重组人载脂蛋白ApoA-I表达条件的优化

对大肠杆菌DH5α发酵培养表达人载脂蛋白ApoA I的发酵条件进行了优化研究。结果表明 :将重组质粒pBV2 2 0 ApoA I转化不同的大肠杆菌宿主菌 ,筛选得高表达水平的E coliDH5α pBV2 2 0 ApoA I表达系统 ,摇瓶发酵表达率为 2 2 2 % ,BL2 1 (DE3)的表达水平与其相当 ,而TG1的表达率只有 1 1 %。在FMG 5L发酵罐进行发酵条件优化 ,认为细胞生长培养的最适pH为 7 0 ,重组ApoA I表达时的最适pH为 7 4。分批发酵的初始糖浓度为 3 0g·L 1,且碳氮源的最佳比例为 2∶1 ,使重组ApoA I表达率达总蛋白的 40 % ,浓度达 2 86g·L 1。

重组人载脂蛋白E3在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的在毕赤酵母中高效表达重组人载脂蛋白E3(rhApoE3),制备与天然hApoE3具有相同结构和活性的rhApoE3。方法用RT-PCR法自人肝组织RNA克隆hApoE3的cDNA,构建真核分泌型表达载体pPICZα/hApoE3。经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X33。甲醇诱导后进行SDS-PAGE、Western印迹分析,筛选高表达工程菌。结果经PCR法克隆的hApoE3DNA序列与GenBank登录的序列一致。SDS-PAGE和Western印迹分析均在分子量约34kD出现特异性条带,rhApoE3表达量达150mg/L。结论在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生rhApoE3,获得高效表达rhApoE3的毕赤酵母工程菌。

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白AI的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载脂蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JM109宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。

人重组载脂蛋白E在大肠杆菌中的表达和纯化

用含有载脂蛋白EcDNA的PET32a原核表达载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,使之高效表达载脂蛋白E thioredoxin融合蛋白。利用融合蛋白上的一段组氨酸序列 ,用镍离子亲合层析柱进行分离纯化。由于在载脂蛋白E和thioredoxin之间存在凝血酶的识别位点 ,用凝血酶消化后 ,经SephacrylS 30 0凝胶过滤得到人重组载脂蛋白E。用此方法可以从 1L大肠杆菌培养液中纯化 2 0～ 30mg高纯度的各种载脂蛋白E异构体和非自然存在的突变体 ,方法简便 ,产量高 ,纯度达 95 %以上。

重组人载脂蛋白E3发酵条件的优化及纯化

目的研究重组人载脂蛋白E3(rhApoE3)在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及rhApoE3的纯化方法。方法分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生rhApoE3的发酵过程进行了优化;通过阳离子交换层析和反向疏水层析,对rhApoE3的纯化方法进行了研究。结果确定rhApoE3在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在pH6.0的条件下,以0.5%甲醇诱导72h,经过阳离子交换层析和反向疏水层析,rhApoE3纯度可达94%以上。结论确定了rhApoE3在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及rhApoE3的纯化方法。

藤黄酸-重组高密度脂蛋白纳米粒的制备及评价

采用胆酸钠法制备藤黄酸(GA)重组高密度脂蛋白纳米粒(GA-rHDL-NPs),并测定其形态、粒径、Zeta电位、包封率和载药量等理化性质,同时以透析法研究制剂的体外释药特性,细胞实验考察肿瘤细胞对其的摄取能力,溶血性试验和家兔耳缘静脉刺激性试验评价其静脉注射的安全性。结果显示,GA-rHDL-NPs外观呈类球形,平均粒径为(113.53±2.50)nm,Zeta电位为-(29.48±0.05)mV,包封率和载药量分别为(95.30±0.37)%和(8.51±0.95)%,其水分散液4℃放置一个月稳定;GA-rHDL-NPs体外24 h和72 h的累积释放量分别为24.3%和73.6%,其肝肿瘤细胞(HepG2)摄取能力明显强于正常肝细胞(L02),且无明显溶血作用和耳缘静脉刺激性反应。研究结果表明,GA-rHDL-NPs的药物包封率高,性质稳定,药物释放缓慢,分散性和安全性良好,可供静脉注射使用,并具有良好的肿瘤细胞摄取能力。

载脂蛋白AⅠ的抗动脉粥样硬化功能研究进展

载脂蛋白AⅠ是高密度脂蛋白的主要蛋白质组分,其脂质结合型和脂质游离型表现为不同的构象,在胆固醇代谢过程中发挥重要作用。动物实验及临床试验表明,载脂蛋白AⅠ及其重组体、模拟肽等类似物都具有显著的抗动脉粥样硬化作用,具有广阔的临床应用前景。

冠心病心肌缺血患者电针及药物治疗后载脂蛋白的变化

载脂蛋白测定已作为动脉粥样硬化(AS)、冠心病(CHD)、脑卒中等脂类危险因素评估的指标之一.本文观察冠心病心肌缺血患者治疗前后血清载脂蛋白的ApoA-Ⅰ、ApoB及ApoA-Ⅰ/ApoB比值的变化.

泸州地区正常人群载脂蛋白A_I,B_(100)及脂蛋白(a)的调查

测定泸州地区250名健康人血清中的载脂蛋白（Apo）A－I．B_100及脂蛋白（a）［LP（a）］水平。结果:ApoA－I：1．29±0．24g／L，ApoB_100:0．66±0．18g／L，Apo－I／ApoB_100：2．05±0.64,LP（a）：上限值为300mg／L，并与几个城市的结果作了比较。

人载脂蛋白M的表达与纯化

目的:表达人细胞外全长结构域重组人载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)并将其纯化。方法:利用人类肝脏cDNA文库做模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增ApoM DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pGEXT相应位点,插入E.coli JM109,转化E.coli DL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。结果:PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实在SDS-PAGE上出现一条560bp的基因片段。测序结果与GenBank公布的人ApoM基因序列完全一致。ApoM cDNA基因片段经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子量24kD左右出现新的蛋白条带。结论:成功克隆出人ApoM基因,重组表达出ApoM蛋白。

老年男性冠心病和高血压病病人中载脂蛋白apo A-I与apo B-100的调查

本文对378名老年男性进行了apo A-Ⅰ与apo B-100的调查。结果表明,健康老年男性apo A-Ⅰ为1.48±0.3g/L.apo B-100 0.97±0.28g/L;冠心病病人apo B-100增高(P<0.01);高血压病人apo A-Ⅰ降低(P<0.05),apo B-100增高(P<0.01)。这提示apo的变化可能是高血压病人易罹患冠心病的原因。apo B-100与胆固醇呈正相关(r=0.22.P<0.05),apo A-Ⅰ与纤维蛋白原呈负相关(r=-0.20.P<0.05),推测高apo A-Ⅰ与低apo B-100是冠心病的保护因素。

载脂蛋白A-Ⅰ分子生物学研究

载脂蛋白A-I是高密度脂蛋白的主要蛋白成份,它的存在与动脉粥样硬化呈负相关,目前对它的研究已成为这一领域的中心课题之一。本文论述ApoA-I蛋白结构、功能与分子变异体、ApoA-I基因结构,以及ApoA-I在染色体上的定位。并着重介绍ApoA-I基因限制性片段长度的多态性与动脉粥样硬化发生之间的关系。

相关蛋白在携带载脂蛋白-J基因大鼠BMSCs中的表达及意义

目的检测重组质粒pEGFP-N1-apoJ在不同量、不同时间条件下转染大鼠骨髓间充质干细胞的瞬时转染效率,并测定载脂蛋白-J(ApoJ)在靶细胞中能否高表达。方法贴壁培养细胞,并用脂质体LipofectaminTM2000分别介导0.8、1.2、1.6、2.0μg重组质粒pEGFP-N1-apoJ转染,置荧光显微镜下观察转染结果,测定在24、48、72h时间点的瞬时转染效率。蛋白免疫印迹法分别检测pEGFP-N1-apoJ质粒转染组、空pEGFP-N1质粒转染组、空白对照组ApoJ的表达情况。结果不同的质粒量中1.6μg pEGFP-N1-apoJ质粒与3.0μL脂质体制备的复合物瞬时转染效率最高,分别作用24、48、72h可达27.8%、34.3%、28.2%。蛋白免疫印迹法检测到pEGFP-N1-apoJ质粒组大量ApoJ表达,空质粒及空白对照组见微量ApoJ表达;并且pEGFP-N1-apoJ质粒组Apo-J的表达明显高于空载体及空白对照组(P<0.05)。结论利用脂质体介导可将重组质粒pEGFP-N1-apoJ成功转染入大鼠骨髓间充质干细胞,ApoJ在大鼠骨髓间充质干细胞中得到大量表达。

载脂蛋白-J质粒转染大鼠BMSCs及其在靶细胞中的表达

目的对比pEGFP-N1-apoJ质粒在不同DNA浓度条件下转染骨髓间充质干细胞的转染率,并测定载脂蛋白-J的表达情况。方法 0.8、1.2、1.6、2.0μg pEGFP-N1-apoJ质粒分别在脂质体的介导下转染大鼠骨髓间充质干细胞,并在荧光显微镜下观察,确定24、48、72h时转染率,筛选出能获得最高转染率的质粒的量。设置pEGFP-N1-apoJ质粒组、空pEGFP-N1质粒组、空白对照组,用蛋白免疫印迹法检测载脂蛋白-J在24、48、72h3个时间点的表达情况。结果 4个不同质粒浓度组转染率分别为:(16.7±1.0)%、(19.7±1.4)%、(30.1±3.6)%、(21.7±5.5)%,比较4个组间转染效率差异有统计学意义(P<0.05),且1.6μg pEGFP-N1-apoJ质粒组转率最高。通过蛋白免疫印迹法检测后,3个目的蛋白灰度值与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)灰度值相比较,蛋白质相对表达水平为:pEGFP-N1-apoJ质粒组1.91±0.12,空pEGFP-N1质粒组0.56±0.11,空白对照组0.57±0.17,差异有统计学意义(P<0.05)。结论质粒pEGFP-N1-apoJ可在脂质体的介导下转染入大鼠骨髓间充质干细胞,携带载脂蛋白-J基因的靶细胞可表达载脂蛋白-J。

重组复合纤维对高脂血症大鼠脂代谢的影响

目的 : 研究不同剂量水平的重组复合纤维 ( AFC)对高脂血症大鼠脂代谢的影响 ,从分子水平探讨 AFC降脂机制 ,寻找安全剂量。方法 : 断乳 SD大鼠 60只 ,雌雄各半 ,经高脂饲料诱导成高脂血症模型后 ,按体重和血浆总胆固醇均衡的原则分为 5组 ,以高脂饲料和正常饲料为对照组 ,其余三组分别饲以不同水平 ( 5%、1 0 %、2 0 % )的重组复合纤维 ,观察重组复合纤维对大鼠血清、肝脏胆固醇及粪胆汁酸代谢的影响 ,应用半定量逆转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)观察肝脏Apo- AI基因表达的情况。结果 : ( 1 ) 2 0 %的重组复合纤维可显著降低大鼠的体重 ;( 2 )不同剂量水平的重组复合纤维均可显著降低大鼠的血浆总胆固醇 ( TC)和肝脏胆固醇 ( LCH)水平 ,2 0 % AFC的作用最强 ;( 3)大鼠粪胆汁酸的含量与 AFC的剂量水平成反比例 ;( 4 )高剂量水平的重组复合纤维可显著促进肝脏 Apo- AI基因的表达 ,而低剂量水平的重组复合纤维不能刺激其表达。结论 : 各剂量水平的重组复合纤维均具有长期稳定的降脂效果 ,高剂量水平的重组复合纤维降脂作用最强。肝脏载脂蛋白 - AI基因表达增加可能是重组复合纤维降脂机制之一。

高密度脂蛋白(HDL)抗动脉粥样硬化研究进展

血浆高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)通过其载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,ApoA-I)介导胆固醇逆向转运,呈现抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)功能。近来大量研究结果显示高密度脂蛋白的多种抗AS、抗炎功能与胆固醇代谢无关,而是由其联结的鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate,S1P)和ApoA-I分别通过S1P受体和清道夫受体B-I(scavenger receptor class BI,SR-BI)介导的细胞内信号通路来实现。

人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白真核表达载体的构建和鉴定

目的构建人NGAL重组蛋白真核表达载体并转染HEK293T细胞进行瞬间表达。方法从人白细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增NGAL基因并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/HisA中构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/His A-NGAL,经测序鉴定正确后用脂质体转染HEK293T细胞,用Western blot和ELISA方法鉴定表达产物。结果获得长度597bp的NGAL蛋白基因并构建pcDNA3.1/His A-NGAL真核表达载体,测序正确后转染,用Western blot和ELISA方法证实HEK293T细胞可以表达NGAL重组蛋白并分泌出胞。结论成功构建人NGAL重组蛋白真核表达载体,转染HEK293T细胞表达出相应蛋白,为下一步的研究奠定了基础。

重组HDL—S1P颗粒对巨噬细胞胆固醇转运子表达的影响

目的循环中鞘磷脂信号分子鞘氨醇-1-磷酸（S1P）主要富集于高密度脂蛋白（HDL）颗粒并对HDL的内皮保护功能产生重要影响。重组HDL颗粒是研究与治疗动脉粥样硬化性疾病的重要手段，其成分和含量决定其功能。以载脂蛋白AI（ApoAl）和S1P为主要成分的重组HDL对内皮细胞保护功能已有报道。但对胆固醇流出机制作用如何尚未见报道，本研究采用含有不同比例S1P的重组HDL，观察其对巨噬细胞胆固醇流出重要的转运子的作用。方法将含有重组ApoAI、合成磷脂（POPC）和不同含量的S1P混匀，氮气吹干后通过胆酸钠透析法得到重组HDL．S1P颗粒。制备得到的5种重组HDL颗粒内成分最终摩尔浓度比为POPC：S1P：ApoAI=100／0／0、99／0／1、94／6／1、88／12／1、76／24／1。非变性条件下凝胶电泳检测重组HDL颗粒大小以判断效果。透析后于72h内用于干预巨噬细胞系RAW264．7，观察其胆固醇转运子的表达变化。结果给予重组HDL分别干预0、6、12及24h后，ATP结合盒转运子A1（ABCAl）、G1（ABCGl）和清道夫受体BI（sR．BI）mRNA表达无明显变化，Westernblot结果进一步证实各组间ABCAl、ABCGl和sR-BI表达无明显差异。结论含有不同S1P比例的重组HDL对RAW264．7的胆固醇转运子ABCAl、ABCGl和SR．BI表达无明显作用。

口服重组酵母(ApoB100肽段)对小鼠产生特异性抗体的诱导作用

【目的】开发一种针对低密度脂蛋白成分ApoB100的新型重组酵母疫苗,为动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的防治提供一种思路。【方法】利用PCR得到包含编码ApoB100的3 136-3 155位氨基酸残基的目的片段,将其克隆到酵母表达载体JMB88-HA-OVA-MCS上,构建JMB88-HA-OVA-hApoB载体,用硫酸铜诱导表达后获得HA-OVA-hApoB融合蛋白。采用口服的方法对昆明小白鼠免疫成功表达HA-OVA-hApoB蛋白的酵母细胞12周,每周1次,每次1×108个酵母细胞,免疫结束后4周采血,用Western blot检测小鼠是否产生特异性抗体。【结果】PCR扩增获得了859bp的人ApoB100基因。成功构建了JMB88-HA-OVA-hApoB载体。口服免疫12周后,HA-OVA-hApoB免疫组小鼠的血清中含有特异性ApoB100抗体。【结论】灌服表达人ApoB100肽段融合蛋白的重组酿酒酵母能诱导小鼠的免疫反应,使其产生特异性抗体。

人apoA-I分泌型表达调控细胞模型构建

分别从pMD18-T质粒和人基因组DNA扩增出人apoA-I CDS区序列和apoA-I启动子(702bp片段),与pEGFP-N1重组,构成受apoA-I启动子调控的pEGFP-N1质粒和融合蛋白表达质粒,分别转染人肝癌HepG2细胞,以绿色荧光为标志筛选稳定转染系列克隆。用RT-PCR、荧光显微镜、免疫荧光术等鉴定其中一个克隆融合蛋白的表达;分别以胰岛素和葡萄糖刺激物鉴定该克隆的外源apoA-I启动子调控。结果表明:人apoA-I分泌型表达调控肝细胞模型初步建成。