重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠骨髓造血损伤的修复作用

目的探讨小鼠受到辐射后,重组人骨形成蛋白成熟肽-4(rhBMP-4m)对辐射引起的骨髓造血损伤的修复作用。方法通过60 Coγ射线照射,建立小鼠骨髓造血损伤模型,经rhBMP-4m连续治疗后,抽血检测小鼠外周血白细胞数,并进行骨髓单个核细胞计数,对脾结节进行计数并通过流式细胞仪检测骨髓单个核细胞中CD34+细胞比例,比较辐射组和实验组之间的差别。结果经rhBMP-4m治疗的小鼠,白细胞数、单个核细胞数、脾结节数和CD34+细胞比例均明显高于辐射组(P<0.05)。结论对于辐射引起的小鼠骨髓造血损伤,rhBMP-4m能够加快骨髓造血系统的重建。

重组人骨形成蛋白成熟肽4对急性放射损伤小鼠造血系统的修复作用

目的探讨重组人骨形成蛋白成熟肽-4(rhBMP-4m)对^(60)Coγ射线照射引起的小鼠造血系统损伤的修复作用。方法 90只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组和rhBMP-4m治疗组,每组30只。模型组和rhBMP-4m治疗组小鼠接受^(60)Coγ射线照射,照射剂量7 Gy,全身照射200 s;正常对照组小鼠不接受照射。模型组小鼠每日腹腔注射生理盐水1.0 mL,rhBMP-4m治疗组小鼠每日腹腔注射rhBMP-4m 0.5 mg,连续治疗6 d。分别于照射后第1、3、5、7、9天检测小鼠外周血白细胞数、骨髓单个核细胞数、骨髓单个核细胞中CD34^+细胞比例;照射后第9天进行脾结节计数,并计算脾脏质量与体质量的比值(脾体比)。结果照射后第1天3组小鼠外周血白细胞计数比较差异均无统计学意义(P>0.05);照射后第3、5、7、9天模型组小鼠外周血白细胞计数低于正常对照组(P<0.01);照射后第3、5天rhBMP-4m治疗组小鼠外周血白细胞计数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),照射后第7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠外周血白细胞计数高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠照射后各时间点骨髓单个核细胞计数均低于正常对照组(P<0.01)。照射后第1、3天rhBMP-4m治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),照射后第5、7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠照射后各时间点的单个核细胞中CD34^+细胞百分率均低于正常对照组(P<0.01)。rhBMP-4m治疗组小鼠照射后第1、3天单个核细胞中CD34^+细胞百分率与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05),照射后第5、7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠单个核细胞中CD34^+细胞的百分率高于模型组(P<0.05)。照射后第9天,模型组小鼠脾结节计数高于正常对照组,脾体比低于正常对照组(P<0.05);rhBMP-4m治疗组小鼠脾结节计数和脾体比高于模型组(P<0.01)。结论辐射可引起小鼠骨髓造血系统损伤,rhBMP-4m能够促进骨髓造血系统的重建。

重组人骨形成蛋白成熟肽-2对辐射小鼠骨髓造血损伤的修复作用

目的:探讨重组人骨形成蛋白成熟肽-2(recombinanthumanbonemor-phogeneticprotein-2mrhBMP-2m)对辐射引起的小鼠骨髓造血损伤的修复作用。方法:通过60Coγ射线照射小鼠,建立骨髓造血损伤动物模型;经rhBMP-2m连续治疗后,比较照射对照组和rhBMP-2m治疗组之间,骨髓单个核细胞数和蛋白含量的差异;同时,通过酶联免疫吸附试验(ELISA),检测骨髓细胞中CD34分子表达水平的变化。结果:经rhBMP-2m治疗后的动物,其单个核细胞数、蛋白含量和CD34分子的表达水平明显高于照射对照组(P<0.05,n=5)。结论:辐射引起的小鼠骨髓造血损伤,rhBMP-2m能够增加造血细胞数量,促进骨髓细胞CD34分子表达,加速造血损伤的修复过程。

基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化

含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。

根癌农杆菌介导法获得烟草转人骨形成蛋白-3成熟肽基因植株

利用冻融法将质粒 p CAMBIA- h BMP- 3 m直接转入根癌农杆菌 LBA440 4 ,以烟草无菌苗叶盘为外植体 ,通过农杆菌介导法进行遗传转化 ,获得了在含 2 5 mg/L潮霉素 (Hy-gromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株 ,经 PCR检测呈阳性 ,初步鉴定并筛选整合了人骨形成蛋白 -

根癌农杆菌介导的人骨形成蛋白-3成熟肽基因向油菜转化的研究

用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养法,将骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)基因导入甘蓝型自交系油菜(BrassicanapusL.)品种秦油-3号,并获得了hBMP-3m基因整合到油菜基因组中的植株。试验所用外植体为油菜4～5d苗龄的下胚轴;根癌农杆菌为LBA4404,其Ti质粒pCAMBIA-hBMP3m含hBMP-3m基因。切取2mm左右的下胚轴侵染根癌农杆菌后在分化培养基(MS+5.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)上共培养2d,然后转到附加25mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的分化培养基上。切下分化出的茎芽,插入附加25mg/L潮霉素的生根培养基(MS+0.4mg/LIBA)中,形成完整的植株。经PCR检测和Southernblot分析,证实hBMP-3m基因已插入到油菜细胞基因组中。

重组人骨形成蛋白-4的大规模制备

含有能够高表达重组人骨形成蛋白成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP- 4m)质粒的工程菌株,导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,测定发酵菌液OD600值为30．8。离心收集菌体, PAGE电泳后光密度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的42％。悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的83．2％。预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上SP-Sepharose FF阳离子柱,以0.35 mol NaCl洗脱,获得纯度为96％的hBMP-4m。其收获量为1．34g/L发酵液;收得率为36．4％。结果表明:使用这套工艺流程大规模制备hBMP-4m,能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度。

家兔关节软骨骨形成蛋白-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的 证实家兔膝关节软骨中骨形成蛋白-7(BMP-7)的表达,获得BMP-7成熟肽基因。方法 提取家兔膝关节细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增BMP-7成熟肽基因并克隆人T载体,筛选阳性克隆质粒进行核酸序列分析。结果 PCR扩增得到一特异性的约630 bp片段,克隆后筛选出阳性克隆质粒,序列测定结果表明与发表的BMP-7成熟肽基因序列一致。结论 家兔膝关节软骨细胞中有BMP-7成熟肽基因的表达,克隆得到了BMP-7成熟肽基因,为BMP-7在软骨发育中的作用及其功能研究奠定了基础。

人重组骨形成蛋白-4与人重组胰岛素样生长因子-Ⅰ联合应用对大鼠成骨细胞的影响

目的探讨人重组骨形成蛋白-4(recombinant human bone morphogenetic protein-4,rhBMP-4)与人重组胰岛素样生长因子-Ⅰ(recombinant human insulin-like growth factor-Ⅰ,rhIGF-Ⅰ)联合应用对大鼠成骨细胞生长增殖及分化能力的影响。方法取大鼠颅盖骨组织块,采用改良组织块混合酶消化法培养成骨细胞,将第四代成骨细胞与10 ng/mL rhBMP-4(rhBMP-4组)、10 ng/mL rhIGF-Ⅰ(rhIGF-Ⅰ组)、10 ng/mL rhBMP-4加10ng/mLrhIGF-Ⅰ(联合组)、无血清低糖培养基(对照组)共同培养3 d,用噻唑蓝法测定细胞的增殖情况,用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶的活性,用羟脯氨酸试剂盒检测成骨细胞分泌Ⅰ型胶原的量。结果第3天时,4组促进大鼠成骨细胞增殖能力测定的光密度值差异具有统计学意义(F=4.080,P=0.016),碱性磷酸酶活性差异具有统计学意义(F=4.070,P=0.016),成骨细胞分泌Ⅰ型胶原的差异具有统计学意义(F=3.204,P=0.038);与对照组相比,rhBMP-4组,rhIGF-Ⅰ组及联合组,都可增强成骨细胞的增殖分化能力,但rhBMP-4和rhIGF-Ⅰ联合应用不比单独应用的作用强。结论 rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用,不能协同促进大鼠成骨细胞增殖及分化能力。

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的扩增、克隆和序列测定

骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)作为TGF-β超家族成员,可以诱导未分化的间质细胞向软骨细胞分化,然后通过软骨内成骨形成骨组织,对难治性骨折的愈合及各种骨缺损的修复有明显的促进作用。另外,BMP在胚胎发生和神经发育过程中也起重要作用。但是由于BMP在骨组织中含量甚微,提取方法繁琐,故不能满足临床应用和基础研究需要,随着人BMP(hBMP)1～13 cDNA基因的克隆,人们已在COS。

大肠杆菌表达的重组人BMP-2和hBMP-4成熟肽大规模制备方法的比较

目的:大规模制备人骨形成蛋白成熟肽(hBMP-m):hBMP-4m和hBMP-2m.方法:两种工程菌株分别含有能够高表达hBMP-4m和hBMP-2m的质粒,分别导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,离心收集菌体,悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次.预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体分别用8 mol/L尿素缓冲液溶解,上Sepharose SP-FF阳离子柱.结果:发酵菌液A600 nm值分别为28.8和26.3.SOS-PAGE电泳后吸光度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的40.0%,hBMP-2m占细菌总蛋白量的47.2%.洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的82.9%,hBMP-2m占蛋白量的84.5%.上Sepharose SP-FF阳离子柱后,分别收集0.35 mol/L NaC l和0.20 mol/L NaC l洗脱部分,获得纯度为96%的hBMP-4m及纯度为95%的hBMP-2m.其收获量分别为1.30 g/L发酵液和1.25 g/L发酵液;收得率分别为34.33%和34.81%.结论:大规模制备hBMP-4m和hBMP-2m时,使用相同的发酵程序及相近的纯化方法,都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度.

重组人骨形成蛋白-4对人成骨样细胞MG-63增殖分化的影响

目的:探讨重组人骨形成蛋白-4(rhBMP-4)对人成骨样细胞MG-63的增殖分化的影响。方法:人成骨样细胞系MG-63用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养在5%CO2、37℃培养箱中,rhBMP-4诱导后用MTT比色法测定细胞增殖,用PNP比色法测定细胞碱性磷酸酶活性,羟脯氨酸测定试剂盒测定细胞羟脯氨酸含量。结果:5、10、20 ng/mL的rhBMP-4均能诱导MG-63细胞的增殖(P<0.05),且呈浓度及时间依赖性;10 ng/mL rhBMP-4能增强MG-63细胞的碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原的分泌(P<0.05)。结论:rhBMP-4能诱导人成骨样细胞MG-63的增殖及分化。

重组人骨形态发生蛋白-2原核表达及单克隆抗体制备

目的利用原核表达系统(E.coli)表达纯化重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m),并制备rh-BMP-2m的单克隆抗体。方法将工程菌株进行常规发酵,自诱导表达,裂菌离心分离包涵体,包涵体变性后经阳离子交换色谱分离纯化。纯化后的变性rhBMP-2m经稀释复性,获得具有生物学活性的rhBMP-2m。并以此作为抗原,免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。结果获得还原SDS-PAGE下95%以上纯度的rhBMP-2m。细胞活性结果分析显示,所获得的rhBMP-2m具有较强的生物学活性。免疫小鼠最终获得两株稳定分泌抗rhBMP-2m抗体的杂交瘤细胞株。结论成功制备了具有生物学活性的rhBMP-2m及其单克隆抗体,为rhBMP-2未来的研究和制备奠定良好的基础。

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的 探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法 用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果 免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论 重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。

rhBMP-4对大鼠成骨细胞增殖及分化能力的影响

目的 探讨rhBMP-4对大鼠成骨细胞生长增殖及分化的影响.方法 取大鼠颅盖骨组织块,采用改良组织块混合酶消化法培养成骨细胞,将不同浓度的rhBMP-4加入第4代成骨细胞的培养基继续进行细胞培养,用MTT法测定细胞在第1,3,5 天的增殖情况,用碱性磷酸酶试剂盒检测成骨细胞碱性磷酸酶的活性.结果 第1,3,5 天,5～40 ng/ml的rhBMP-4对成骨细胞的生长增殖能力的影响与对照组比较差异均有显著性（P＜0.05）;第1,3 天,5～40 ng/ml的rhBMP-4对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响与对照组比较差异均有显著性（P＜0.05）,第5天,rhMP-4各浓度组与对照组比较无统计学意义.结论 在一定时间范围内,rhBMP-4对成骨细胞生长增殖及分化有促进作用.

不同复性方法制备的rhBMP-2m诱导异位成骨活性比较

目的:用三种不同方法复性重组人骨形成蛋白2成熟肽(rhBMP-2m),比较其异位诱骨活性.方法:将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的rhBMP-2m用三种不同方法复性:①对pH4.8复性液透析复性;②对pH9.0复性液稀释复性;③对pH6.5复性液透析复性.不加任何载体,1mg复性后rhBMP-2m直接植入小鼠肌肉观察诱骨生成.结果:得到纯度为98%的rhBMP-2m.①pH4.8透析复性后蛋白可溶.经过滤除菌,可溶性rhBMP-2m没有损失.冻干后植入肌袋,2wk后诱导生成软骨,4wk诱导生成骨小梁.②pH9.0稀释复性后虽然肉眼观察蛋白似为可溶,但经除菌膜过滤rhBMP-2m损失90%以上.冻干后植入肌袋,1wk诱导生成软骨,2wk诱导软骨内成骨,3wk出现骨小梁.③pH6.5透析复性后蛋白不可溶,植入肌袋,2wk诱导生成骨小梁,4wk后出现骨髓样细胞.结论:相比酸性和碱性条件,中性条件下复性的rh-BMP-2m的诱骨活性最好,但酸性条件下复性的rhBMP-2m溶解度好.

hBMP-3m基因在烟草中的表达

PCR扩增人骨形成蛋白-3成熟肽 hBMP-3m cDNA,纯化后连接入pUC19质粒,构建克隆载体pUC19B3m;用EcoR 和Hind 酶解pUC19B3m和pJIT163,将目的片段插入pJIT163,构建中间载体pJIT163-B3m;再构建植物表达载体pCAMBIA1300-B3m.利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP3m转入根癌农杆菌 A-grobacteriumtumefaciens LBA4404.以烟草 NicotianatabacumL. 无菌苗叶盘为外植体,通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg/L潮霉素 Hygromycin,Hyg 的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR证实其中部分植株已将人骨形成蛋白-3成熟肽基因整合到烟草基因组中,WesternBlot结果表明已有微量BMP表达.

rhBMP-2m在高浓度条件下的复性

目的:优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽(rh-BMP-2m)的复性条件.方法:将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH,氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性.透析复性后进行非还原的SDS-PAGE,检测rhBMP-2m活性形式二聚体的含量,同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22μm微孔滤膜除菌并计算其损失率.结果:经透析复性后rhBMP-2m完全可溶,而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右,即复性后二聚体的rhBMP-2m可以达到每升发酵液800 mg,并且经微孔滤膜除菌后rhBMP-2m活性形式二聚体的含量基本没有损失,同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%.结论:高pH有利于rhBMP-2m的复性,除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP-2m复性后仍保持可溶.蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大,但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大.