重组人骨形成蛋白成熟肽-2对辐射小鼠骨髓造血损伤的修复作用

目的:探讨重组人骨形成蛋白成熟肽-2(recombinanthumanbonemor-phogeneticprotein-2mrhBMP-2m)对辐射引起的小鼠骨髓造血损伤的修复作用。方法:通过60Coγ射线照射小鼠,建立骨髓造血损伤动物模型;经rhBMP-2m连续治疗后,比较照射对照组和rhBMP-2m治疗组之间,骨髓单个核细胞数和蛋白含量的差异;同时,通过酶联免疫吸附试验(ELISA),检测骨髓细胞中CD34分子表达水平的变化。结果:经rhBMP-2m治疗后的动物,其单个核细胞数、蛋白含量和CD34分子的表达水平明显高于照射对照组(P<0.05,n=5)。结论:辐射引起的小鼠骨髓造血损伤,rhBMP-2m能够增加造血细胞数量,促进骨髓细胞CD34分子表达,加速造血损伤的修复过程。

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。

重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠骨髓造血损伤的修复作用

目的探讨小鼠受到辐射后,重组人骨形成蛋白成熟肽-4(rhBMP-4m)对辐射引起的骨髓造血损伤的修复作用。方法通过60 Coγ射线照射,建立小鼠骨髓造血损伤模型,经rhBMP-4m连续治疗后,抽血检测小鼠外周血白细胞数,并进行骨髓单个核细胞计数,对脾结节进行计数并通过流式细胞仪检测骨髓单个核细胞中CD34+细胞比例,比较辐射组和实验组之间的差别。结果经rhBMP-4m治疗的小鼠,白细胞数、单个核细胞数、脾结节数和CD34+细胞比例均明显高于辐射组(P<0.05)。结论对于辐射引起的小鼠骨髓造血损伤,rhBMP-4m能够加快骨髓造血系统的重建。

重组人骨形成蛋白-2促进兔下颌牵张成骨的研究

目的 研究局部应用基因重组人骨形成蛋白_2 (rhBMP_2 )对兔下颌牵张成骨的影响。方法 在 12只成年大耳白兔的双侧下颌骨前部行骨切开术 ,将rhBMP_2与胶原复合植入一侧下颌骨切开处 ,另一侧单纯植入胶原作对照。用自行研制牵张器延长双侧下颌骨 6mm ,在牵张结束后第 4周处死动物 ,取双侧牵张区新生骨痂行组织学、扫描电镜及Ca/P元素测定。结果 下颌延长后两侧牵张间隙均有新骨形成 ,应用rhBMP_2的一侧牵张骨痂中的新骨组织比对照侧多而成熟 ,钙化程度较高。结论 基因重组人骨形成蛋白_2可能有促进兔下颌牵张成骨的作用。

人骨形成蛋白-2重组腺病毒表达载体的构建

目的 构建人骨形成蛋白 - 2 (BMP- 2 )基因的重组腺病毒表达载体 ,为应用 BMP- 2基因治疗的研究奠定基础。方法 首先构建携带 BMP- 2基因的腺病毒穿梭质粒 p Ad CMV- BMP- 2 ,在脂质体介导下 ,与腺病毒基因组质粒 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得重组腺病毒 Ad- BMP- 2。结果 经限制性酶切和 PCR扩增鉴定 ,证实为复制缺陷型 BMP- 2重组腺病毒。结论 成功构建了 BMP- 2腺病毒表达载体。

模拟失重下大鼠骨和骨髓中人重组骨形成蛋白-2的变化

目的研究模拟失重骨质和骨髓内人重组骨形成蛋白 2 (Humanrecombinationbonemorphogeneticprotein 2 ,rhBMP 2 )形态学的变化。方法选用SD大鼠 ,随机配对分为悬吊组和自由活动组 ( 5只 /组 ) ,实验期为 1 4、2 8d。组织标本行原位杂交。结果尾吊组大鼠骨质和骨髓内rhBMP 2的表达明显弱于对照组 (P <0 .0 5) ;尾吊组 1 4drhBMP 2的表达明显强于 2 8d(P <0 .0 5)。结论大鼠后肢去负荷导致骨和骨髓rhBMP

复合基因重组人骨形成蛋白-2异种骨的研制及成骨活性研究

目的 研制新型具有诱导成骨活性的异种骨植骨材料。方法 在重组合异种骨 (RBX)基础上 ,以基因重组人骨形成蛋白 - 2 (rh BMP- 2 )取代从牛皮质骨中提取的牛 BMP,与去抗原牛松质骨载体 (BCB)复合 ,制成复合 rh BMP- 2的异种骨 (rh BMP- 2 / BCB) ;将 4周龄雄性 BAL B/ C小鼠 6 0只 ,随机分为实验组和对照组 ,于实验组小鼠左股部肌袋植入 rh BMP- 2 / BCB骨粒 ,对照组小鼠左股部肌袋植入 BCB骨粒 ,术后 7、14及 2 1天取材 ,通过组织学、骨计量学方法检测 rh BMP- 2 / BCB的诱导成骨活性。结果 1实验组术后 7天在小鼠肌袋可诱导软骨生成 ,14天形成编织骨 ,2 1天改建成板层骨并形成大量骨髓 ;对照组于术后各时间点均未见有软骨及骨形成。 2实验组的碱性磷酸酶活性和钙含量均高于对照组 ,具有统计学意义 (P<0 .0 1)。结论 rh BMP- 2 / BCB具有较好的骨诱导能力 。

三种钙磷陶瓷材料复合重组人骨形成蛋白-2体内成骨的研究

目的 探讨和比较 3种钙磷陶瓷材料 HA、TCP、HA/ TCP复合重组人骨形成蛋白 - 2 (rh BMP- 2 )体内异位成骨效果 ,为临床应用提供依据。 方法 取 35只 3月龄 Wistar大鼠 ,将复合 rh BMP- 2的 3种钙磷陶瓷材料 (1∶ 1)植于鼠背部肌袋内 ,未复合 rh BMP- 2的上述 3种单纯陶瓷材料为对照组。术后 2、4和 8周取材 ,测定植入物碱性磷酸酶 (AL P)活性 ,通过 HE染色和计算机图像分析进行组织学和组织计量学观察 ,比较新生骨组织的形成。 结果 术后 2、4周复合植入物 AL P活性测定从高到低依次为 HA、HA/ TCP、TCP,但在相同 rh BMP- 2剂量下 ,其差异无统计学意义 (P>0 .0 5 ) ,与相对应单纯支架材料比较有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;组织学和组织计量学检测结果显示各复合材料组均有新骨形成 ,成骨量随时间推移而增加 ,2周时以 HA/ rh BMP- 2成骨量较多 ,但 3组间差异无统计学意义(P>0 .0 5 ) ;8周时新骨形成以双相陶瓷 HA/ TCP最佳 ,相关参数和图像分析有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,成骨量 8周较 2、4周多 ,有统计学意义 (P<0 .0 1) ;3种单纯支架材料各观察期均无骨样组织形成。 结论 双相陶瓷材料 HA/ TCP是携带 rh BMP- 2的钙磷陶瓷良好支架材料。

重组人骨形成蛋白-2与胶原复合物的表面植骨成骨作用研究

目的 评价重组人骨形成蛋白 - 2 (rh BMP- 2 )与胶原复合物在大鼠颅骨表面的成骨作用。方法 用 SD大鼠 9只在两侧颞部各制备一骨膜下袋后 ,分为实验侧和对照侧。右侧植入 rh BMP- 2与胶原复合物为实验侧 ,左侧植入单纯胶原作为对照 ,分别于术后 2、4及 8周处死动物各 3只 ,取标本制作脱钙石蜡切片 ,观察成骨情况 ,并测量成骨厚度。结果 rh BMP- 2与胶原复合物可在颞骨表面通过膜内成骨的方式诱导新骨形成 ,并与颞骨外板良好结合 ,术后 2周 ,植入物大部分降解吸收 ,颞骨表面有大量新生骨 ;术后 4周 ,植入物完全为新骨代替 ,颞骨厚度约为厚原度的 5倍 ;术后 8周 ,新骨更加成熟 ,颞骨厚度约为原厚度 2 .8倍。而对照侧骨质在术后各周均无明显增厚。结论 rh BMP- 2与胶原复合物可作为良好的表面植骨替代材料 。

重组人骨形成蛋白-2对细胞成骨分化的作用

目的进一步探讨ｒｈＢＭＰ－２的促细胞成骨分化作用，以期找到合适的成骨分化标志作为ｒｈＢＭＰ－２的定量活性测定指标。方法 首先表达制备ｒｈＢＭＰ－２，用小鼠股部肌袋包埋法进行诱骨活性实验，然后检测ｒｈＢＭＰ－２作用后的骨髓基质细胞（ＭＳＣ）、ＮＩＨ３Ｔ３和Ｃ２Ｃ１２等３种细胞的碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣ）、细胞总蛋白合成量以及细胞增殖的变化。结果 ｒｈＢＭＰ－２具有良好的诱导骨形成的活性，可增加３种细胞的ＯＣ含量和蛋白合成量，对ＭＳＣ的ＡＬＰ活性变化影响明显，且可促进ＭＳＣ的增殖，抑制ＮＩＨ３Ｔ３细胞的生长。结论 ｒｈＢＭＰ－２具有促进上述细胞向成骨细胞分化的作用；在一定剂量范围内，ｒｈＢＭＰ－２的作用与细胞骨钙素合成量的增加呈线性正相关，故定量测定ＯＣ的含量基本可反映ｒｈＢＭＰ－２的活性。

人重组骨形成蛋白-2诱导NIH3T3细胞向成骨细胞表型转化

目的 探讨人重组骨形成蛋白-2(rhBMP-2)对NIH3T3成纤维细胞生物学行为的影响。方法 培养NIH3T3细胞,加入外源性rhBMP-2,用生长曲线、噻唑蓝(MTT)比色、流式细胞仪(FCM)分析、BrdU检测观察细胞的增殖和DNA合成,并检测碱性磷酸酶(AIP)活性和骨钙素(OC)含量观察细胞是否有成骨趋向。结果 加药组细胞的增殖活性下降、DNA合成变慢,ALP活性和OC含量均增高。结论 rhBMP-2使NIH3T3细胞增殖活性变弱,表现成骨细胞表型。

重组人骨形成蛋白-2复合胶原I盖髓的实验研究

目的 :观察重组人骨形成蛋白 - 2复合胶原I的盖髓效果和对牙髓组织骨钙素含量的影响 ,探讨牙髓细胞分化和修复性牙本质形成的机制 ,为临床筛选理想的盖髓材料提供实验依据。方法 :以 30只猫为实验对象 ,机械暴露牙髓后 ,分别用重组人骨形成蛋白 - 2复合胶原I、氢氧化钙、胶原及对照的牛血清白蛋白盖髓 ,运用组织学方法观察牙髓修复性牙本质的形成及牙髓组织学改变 ,采用放射免疫分析技术检测盖髓后 1周、2周、4周时牙髓组织骨钙素的含量。结果 :与氢氧化钙、胶原和牛血清白蛋白盖髓比较 ,用重组人骨形成蛋白 - 2复合胶原I盖髓 ,能形成完整的管样牙本质桥 ,牙髓组织骨钙素的含量显著多于正常牙髓。结论 :重组人骨形成蛋白 - 2复合胶原I盖髓可诱导形成完整的牙本质桥 ,显著增加牙髓组织骨钙素的含量。重组人骨形成蛋白 - 2复合胶原I作为生物活性盖髓剂 ,起到良好的活髓保存效果 ,值得临床推广应用。

基因重组人骨形成蛋白-2和牛骨形成蛋白异位诱导成骨的比较

目的 :观察基因重组人骨形成蛋白 2 (rhBMP 2 )和牛骨形成蛋白 (bBMP)分别与珊瑚 /聚乳酸形成复合人工骨的异位诱导成骨活性 ,同时比较两种骨形成蛋白的成骨效率。方法 :把rhBMP 2和bBMP分别与珊瑚 /聚乳酸形成复合人工骨 ,进行小鼠肌内种植 1、3、6周后 ,组织学观察和组织形态测量 ,比较其异位诱导成骨活性。结果 :rhBMP 2和bBMP存在骨诱导差异 ,rhBMP 2诱导成骨量相对较少但血管、骨髓含量丰富 ,bBMP则相反。结论 :两种BMP都具有良好的诱骨活性 ,但在成骨量和血管。

重组人骨形成蛋白-2复合1%透明质酸钠骨膜内诱导成骨的实验研究

目的 观察重组人骨形成蛋白 - 2 (rhBMP 2 )复合 1%透明质酸钠骨膜内诱导成骨的组织学过程 ,探讨其诱导成骨的机制。方法 将rhBMP - 2和 1%透明质酸钠复合后植入 9只新西兰大白兔胫骨骨膜下骨皮质的表面 ,对侧植入 1%透明质酸钠作为对照 ,分别于术后第 4、8、12周处死 3只动物取标本进行大体和组织学观察。结果 rhBMP - 2复合 1%透明质酸钠组骨膜内侧有明显的新骨形成 ,新骨呈渐进性的成熟过程 ,12周时和原有骨的组织结构一致。结论 rhBMP - 2和 1%透明质酸钠复合后可以用于骨缺损的修复。

重组人骨形成蛋白-2促进兔下颌牵张成骨的实验研究

目的:研究重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2,rhBMP2)对兔下颌牵张成骨的作用。方法:建立兔下颌双侧牵张成骨动物模型,于下颌右侧骨断端间植入含有rhBMP2的可吸收胶原海绵(absorbable collagen sponge,ACS),左侧单纯应用ACS作为对照。分别于固定期第3、5周末处死动物,取标本行X线及组织学观察。结果:应用rhBMP2侧新骨形成的速度以及骨小梁的密度均高于对照。结论:局部应用rhBMP2能够提高牵张区新骨形成的速度和质量,对下颌牵张成骨具有促进作用。

重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响

目的 研究BMP 2是否对胶质瘤细胞也具有诱导凋亡作用。方法 培养的人脑胶质瘤细胞系SHG 4 4中加入rhBMP 2 ,运用透射电镜观察凋亡的超微结构 ,流式细胞仪技术分析细胞DNA周期变化 ,琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的改变。结果 电镜下可见细胞核染色质浓缩、边集、核碎裂 ;DNA周期分析显示在G1期峰前存在一个凋亡峰 ( 12 1% ) ;DNA电泳呈梯状。结论 rhBMP 2在体外对人脑胶质瘤细胞系SHG 4 4有明显诱导凋亡的作用。

根癌农杆菌介导法获得烟草转人骨形成蛋白-3成熟肽基因植株

利用冻融法将质粒 p CAMBIA- h BMP- 3 m直接转入根癌农杆菌 LBA440 4 ,以烟草无菌苗叶盘为外植体 ,通过农杆菌介导法进行遗传转化 ,获得了在含 2 5 mg/L潮霉素 (Hy-gromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株 ,经 PCR检测呈阳性 ,初步鉴定并筛选整合了人骨形成蛋白 -

根癌农杆菌介导的人骨形成蛋白-3成熟肽基因向油菜转化的研究

用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养法,将骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)基因导入甘蓝型自交系油菜(BrassicanapusL.)品种秦油-3号,并获得了hBMP-3m基因整合到油菜基因组中的植株。试验所用外植体为油菜4～5d苗龄的下胚轴;根癌农杆菌为LBA4404,其Ti质粒pCAMBIA-hBMP3m含hBMP-3m基因。切取2mm左右的下胚轴侵染根癌农杆菌后在分化培养基(MS+5.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)上共培养2d,然后转到附加25mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的分化培养基上。切下分化出的茎芽,插入附加25mg/L潮霉素的生根培养基(MS+0.4mg/LIBA)中,形成完整的植株。经PCR检测和Southernblot分析,证实hBMP-3m基因已插入到油菜细胞基因组中。

重组人骨形成蛋白-2的质量控制

目的建立重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)质控方法和质量标准。方法以小鼠体内异位成骨试验测定rhBMP-2的生物学活性,HPLC-SEC法测定纯度,蛋白N-末端测序仪测定N-末端15个氨基酸残基序列,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果1批rhBMP-2原液鉴定结果显示,样品比活性为5.9×104BU/mg,纯度为97.6%,N-末端序列为(MKR)LKSSCKRHPLYV,其余项目检测结果均符合《中国药典》三部(2005版)的要求。结论该质控标准可用于rhBMP-2产品的常规检定。