重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂静脉溶栓后不同时间加用替罗非班对急性缺血性脑卒中患者神经血管功能的影响

目的探讨重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓后不同时间加用替罗非班对急性缺血性脑卒中(AIS)患者神经血管功能的影响。方法选择2020年3月至2023年3月北京老年医院神经内科收治的120例AIS患者为研究对象,患者均经rt-PA静脉溶栓治疗。根据静脉溶栓治疗后加用替罗非班的时间将患者分为早期组(溶栓后6 h内,n=52)、中期组(溶栓后6~12 h,n=38)和晚期组(溶栓后12~24 h,n=30)。比较治疗前、治疗后3组患者神经功能[美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分、改良Rankin量表(mRS)评分]、血管功能[血管性假血友病因子(vWF)、血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)、血栓调节蛋白(TM)]、炎症因子[高敏C反应蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)、白细胞介素-1β(IL-1β)]水平,记录治疗期间不良事件发生率。结果治疗前,3组患者NIHSS、mRS评分比较差异无统计学意义(P>0.05);3组患者治疗后NIHSS、mRS评分显著低于治疗前(P<0.05);治疗后,早期组患者NIHSS、mRS评分显著低于中期组、晚期组,中期组患者NIHSS、mRS评分显著低于晚期组(P<0.05)。治疗前,3组患者vWF、VE-cadherin、TM水平比较差异无统计学意义(P>0.05);3组患者治疗后vWF、VE-cadherin、TM水平显著低于治疗前(P<0.05);治疗后,早期组患者vWF、VE-cadherin、TM水平显著低于中期组、晚期组(P<0.05);治疗后,晚期组患者vWF水平显著高于中期组(P<0.05),中期组与晚期组患者VE-cadherin、TM水平差比较异无统计学意义(P>0.05)。治疗前,3组患者hs-CRP、Hcy、IL-1β水平比较差异无统计学意义(P>0.05),3组患者治疗后hs-CRP、Hcy、IL-1β水平显著低于治疗前(P<0.05);治疗后,早期组患者hs-CRP、Hcy、IL-1β水平显著低于中期组和晚期组,中期组患者hs-CRP、Hcy、IL-1β水平显著低于晚期组(P<0.05)。治疗期间,3组患者症状性脑出血发生率比较差异无统计学意义(P>0.05);早期组患者再闭塞、心肺并发症发生率显著低于中期组、晚期组(P<0.05);中期组与晚期组患者再闭塞、心肺并发症发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论rt-PA静脉溶栓后不同时间加用替罗非班后均可促进AIS患者神经功能、血管功能恢复,同时可抑制炎症反应,其中早期加用替罗非班效果最佳。

微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白在皮肤屏障功能修复中的应用效果

目的探究微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白治疗因皮肤炎性衰老导致的皮肤屏障功能下降的有效性及安全性。方法选取2020年6月至2021年5月在本院接受面部皮肤治疗的30例患者作为研究对象,采用随机数字表法将其分为对照组(重组Ⅲ型人源化胶原蛋白)与治疗组(微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白),各15例。治疗后定期对患者进行随访,分别进行主观疗效评价及客观疗效评价。结果治疗后4、8、12周,治疗组的满意度显著高于对照组(P<0.05)。治疗后,治疗组的皮肤皱纹、纹理、红区、毛孔、弹性、皮肤经皮失水及皮肤含水量改善明显(P<0.05);对照组治疗后油脂改善明显(P<0.05)。治疗后12周,治疗组的总症状评分显著低于对照组(P<0.05)。结论微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白对皮肤修复有较好的疗效,可增强皮肤屏障功能,为改善皮肤屏障功能、治疗因皮肤屏障受损引起的炎性衰老提供了新选择。

ASIP基因及其重组蛋白对山羊脂肪细胞脂肪沉积的效应

为探索ASIP基因对山羊脂肪沉积的效应,本研究采集波杂山羊(BZ)和酉州乌羊(YZ)组织,并使用体外培养的山羊前脂肪细胞,采用基因克隆、实时荧光定量(qRT-PCR)、油红O染色等方法,检测ASIP基因在山羊组织和体外培养分化脂肪细胞中的表达规律,以及脂质生成关键基因在山羊脂肪和肌肉组织中的表达情况,分析重组ASIP蛋白对山羊脂肪细胞分化过程中脂滴形成及脂质生成关键基因表达的影响。结果表明,ASIP基因在山羊体组织中广泛表达,在肾脏和白色脂肪中的表达量最高;ASIP基因在山羊脂肪细胞分化6 d时显著升高(P<0.05),8 d时达到最高值。PPARG、LEPTIN和ATRN基因在YZ肾脂中的表达量显著高于BZ(P<0.05);PPARG、FASN和ATRN基因在BZ骨骼肌中的表达量显著高于YZ(P<0.05),FABP4和SREBP1基因的表达在两品种羊之间无显著差异。重组ASIP蛋白处理诱导山羊脂肪细胞在8 d出现明显脂肪滴,显著提高了细胞内甘油三酯含量(TG)(P<0.05),并显著或极显著上调脂肪细胞中脂质合成关键基因(PPARG、LEPTIN、FASN、FABP4、SREBP1和ATRN)的表达量。综上,ASIP基因及重组ASIP蛋白对山羊脂肪细胞的脂肪沉积可能具有正向调控作用。本研究结果为进一步解析ASIP基因调控山羊脂肪沉积机制提供了重要理论基础。

重组贻贝粘蛋白在点阵CO_(2)激光治疗面部痤疮萎缩性瘢痕术后创面修复中的应用研究

目的:探究重组贻贝粘蛋白水凝胶敷料(Recombined mussel adhesive protein hydrogel dressing,Rmaphd)在点阵CO_(2)激光治疗面部痤疮萎缩性瘢痕术后创面修复中的应用效果。方法:选择2022年6月-2023年2月面部痤疮萎缩性瘢痕患者117例,分为Rmaphd组、重组人表皮生长因子(Recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)组和对照组,每组39例,三组均给予点阵CO_(2)激光术治疗,术后分别给予Rmaphd、rhEGF及生理盐水处理,比较三组疗效、ECCA评分、症状持续时间以及生活质量评分。结果:Rmaphd组和rhEGF组总有效率分别为92.31%和94.87%,均高于对照组76.92%(P<0.05),术后ECCA评分低于对照组(P<0.05),术后疼痛、红斑、痂皮持续时间短于对照组(P<0.05),Acne-QoL各指标得分优于对照组(P<0.05);上述各临床Rmaphd组与rhEGF组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Rmaphd用于点阵CO_(2)激光治疗面部痤疮萎缩性瘢痕术后创面修复疗效显著,具备在临床上辅助激光治疗术后修复的应用潜力。

重组结核杆菌融合蛋白在肺结核密切接触者中筛查结核分枝杆菌感染效果分析

目的:探讨重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验在筛查肺结核患者密切接触者结核分枝杆菌感染中的实用性和有效性,为进一步优化结核感染检测提供技术建议,了解密切接触者结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)现状。方法:2023年10月23日至11月14日在上海市奉贤区和金山区共选取140名肺结核密切接触者作为研究对象,对每名研究对象同时采用γ-干扰素释放试验(IGRA)和EC皮肤试验进行结核感染检测,采用Kappa值检验两种方法结果一致性,采用χ^(2)检验比较两组检测方法之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:140名研究对象,包括男性55例,女性85例;IGRA阳性率为15.00%(21/140),EC皮肤试验阳性率为14.29%(20/140),两种试验方法一致性检验Kappa值为0.857,差异无统计学意义(χ^(2)=0.029,P=0.866),两种检测方法检测结果为高度一致性;以IGRA作为结核感染的参考标准,EC皮肤试验的敏感度为85.71%(18/21)、特异度为98.32%(117/119)、阳性预测值为90.00%(18/20)、阴性预测值为97.50%(117/120);男性EC阳性率(32.73%,18/55)明显高于女性(2.35%,2/85),差异有统计学意义(χ^(2)=17.983,P<0.001)。结论:EC皮肤试验具有较强的特异性,可用于肺结核密切接触者结核分枝杆菌感染筛查,但受限于使用年龄和接种禁忌证,可采用IGRA对无法进行EC皮肤试验者进行补充检测。

重组贻贝粘蛋白联合他克莫司软膏与抗组胺药治疗面部糖皮质激素依赖性 皮炎的疗效及对皮肤屏障指标的影响

目的:研究重组贻贝粘蛋白联合他克莫司软膏、抗组胺药治疗面部糖皮质激素依赖性皮炎(简称面部皮炎)及对皮肤屏障指标的影响。方法:选取2020年4月-2022年12月笔者医院门诊面部皮炎患者131例,采用随机数字表法分为对照组(n=65)与研究组(n=66)。两组均对面部皮炎进行常规处理,对照组给予他克莫司与氯雷他定治疗,研究组在对照组基础上联合重组贻贝粘蛋白治疗,持续治疗4周后,比较两组皮肤屏障指标(表皮皮脂含量、角质层含水量,经表皮水分丢失量)、自觉症状与客观体征积分、疗效、不良反应。结果:治疗后两组表皮皮脂含量、角质层含水量上升,经表皮水分丢失量下降,且研究组表皮皮脂含量、角质层含水量高于对照组,经表皮水分丢失量低于对照组(P<0.05)。治疗4周后两组自觉症状与客观体征积分下降,且研究组积分低于对照组(P<0.05)。研究组总有效率93.94%高于对照组81.54%(P<0.05)。两组总不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:重组贻贝粘蛋白联合他克莫司软膏、抗组胺药能有效改善面部皮炎患者临床症状,促进恢复皮肤屏障功能,且无明显严重不良反应发生。

医用重组胶原蛋白联合CO_(2)点阵激光治疗皮肤瘢痕的临床疗效

目的探讨医用重组胶原蛋白联合CO_(2)点阵激光治疗皮肤瘢痕的有效性及安全性。方法选取皮肤瘢痕患者54例,按照随机数字表法分为两组各27例,均行CO_(2)点阵激光治疗。点阵激光治疗完成后,对照组给予红霉素软膏外用涂抹,观察组给予医用重组胶原蛋白敷料外用涂抹,均每天2次,持续使用1个月。两组CO_(2)点阵激光治疗联合药物涂抹治疗,每2个月进行1次为1个疗程,共治疗3个疗程。采用温哥华评估量表(VSS)根据血管分布、色泽、厚度、柔软度情况对瘢痕形态进行评分,视觉模拟评分(VAS)评估创面术后疼痛和瘙痒程度;根据VSS评分计算瘢痕改善率,评价临床疗效,治疗期间观察患者不良反应发生情况。采用酶联免疫吸附法测定两组血清转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)。结果治疗3个疗程,两组VSS评分和VAS均较治疗前降低,且观察组VSS评分和VAS低于对照组(P均<0.05);观察组治疗总有效率(96.30%)高于对照组(77.78%),不良反应发生率(7.41%)低于对照组(25.93%),差异均有统计学意义(P均<0.05);两组血清TGF-β1、IL-6、IL-8水平均较治疗前降低,且观察组血清TGF-β1、IL-6、IL-8水平低于对照组(P均<0.05)。结论医用重组胶原蛋白联合CO_(2)点阵激光治疗皮肤瘢痕疗效好且安全性高。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗中毒性表皮坏死松解症的疗效及安全性

目的探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)治疗中毒性表皮坏死松解症(TEN)患者的临床疗效及安全性。方法回顾性选取2020年1月至2022年1月海南医学院第一附属医院TEN患者20例,均给予rhTNFR:Fc治疗。治疗21 d后,记录TEN患者临床疗效,比较治疗前与治疗后不同时段(治疗后7、14、21 d)的药疹面积和严重程度指数(DASI)评分[DASI评分平均值,50%DASI(DASI50)、75%DASI(DASI75)、90%DASI(DASI90)所占比例]、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、体温下降时间、皮疹控制时间、住院时间及药物治疗的安全性。结果治疗21 d后,TEN患者中,显效18例(90.00%),有效2例(10.00%)。TEN患者治疗后7、14、21 d的DASI评分分别为(30.44±5.68)、(5.28±2.31)、(2.04±1.12)分,均明显低于治疗前[(52.34±7.45)分],差异均有统计学意义(P<0.05)。相较治疗前、治疗7 d、治疗14 d,治疗21 d后的DASI50(100.00%)、DASI75(100.00%)、DASI90(90.00%)的改善比率最高,差异均有统计学意义(P<0.05)。TEN患者治疗后7、14、21 d的血清TNF-α水平分别为(22.73±5.58)、(15.99±4.60)、(4.44±1.10)pg/mL,均低于治疗前[(33.63±17.36)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。TEN患者体温下降时间为(2.49±0.81)d,皮疹控制时间为(5.19±1.90)d,住院时间为(11.92±4.20)d。治疗期间患者未出现终止治疗或失访,均未出现急性不良反应,随访期间病情未见复发,定期复查结果显示并无合并症、活动性肝炎与结核疾病等。结论rhTNFR:Fc作为治疗TEN疾病的药物其疗效随治疗时间延长而提高,可降低血清TNF-α水平与DASI评分,且安全性较高。

强脉冲光联合重组人源Ⅲ型胶原蛋白贴敷料对玫瑰痤疮患者的影响

目的评估强脉冲光结合重组人源Ⅲ型胶原蛋白贴敷料在玫瑰痤疮治疗中的临床效果。方法前瞻性研究,选取2020年4月至2023年4月在延安市人民医院皮肤科治疗的122例玫瑰痤疮患者作为研究对象,依据随机数字表法将患者分为强脉冲光组和治疗组,各61例。强脉冲光组男31例、女30例,年龄(31.63±5.57)岁,病程(3.49±1.31)年,接受强脉冲光治疗;治疗组男34例、女27例,年龄(30.18±5.14)岁,病程(3.36±1.27)年,在强脉冲光组基础上采用重组人源Ⅲ型胶原蛋白贴敷料治疗。对比两组患者临床疗效、玫瑰痤疮研究者整体评估(IGA)评分、VISIA红区情况、皮肤生理指标、医生整体评价法(PGA)、痤疮特异性生活质量调查表(Acne-QOL)及治疗相关不良事件。统计学方法采用t检验、χ^(2)检验。结果治疗组治疗后4周的总有效率为91.80%(56/61),高于强脉冲光组的73.77%(45/61),差异有统计学意义(χ^(2)=6.960,P=0.008)。治疗前,两组患者IGA评分、面部VISIA红区检测情况、经皮水分散失值(TEWL)、皮肤油脂、角质层含水量、皮肤损伤程度及生活质量评分比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。治疗后4周,治疗组IGA评分、TEWL、皮肤油脂均低于强脉冲光组[(2.27±0.83)分比(3.83±0.86)分、(12.29±2.91)%比(16.45±2.17)%、(70.31±11.92)μg/cm2比(83.64±13.83)μg/cm2],面部VISIA红区检测情况、角质层含水量、皮肤损伤程度、自我感知、情感功能、痤疮症状、社会功能评分均高于强脉冲光组[(56.82±12.56)分比(42.31±10.97)分、(67.91±11.24)%比(56.26±10.39)%、(2.82±0.87)分比(2.25±0.81)分、(22.52±2.71)分比(18.73±2.52)分、(16.83±2.74)分比(14.32±2.18)分、(20.52±2.46)分比(17.93±2.38)分、(19.74±2.85)分比(15.83±2.14)分],差异均有统计学意义(t=10.194、8.951、5.702、6.796、5.944、3.745、7.999、5.599、5.910、8.568,均P<0.05)。治疗组不良事件发生率为6.56%(4/61),与强脉冲光组[11.48%(7/61)]比较,差异无统计学意义(χ^(2)=0.899,P=0.343)。结论强脉冲光联合重组人源Ⅲ型胶原蛋白贴敷料在治疗玫瑰痤疮应用中显示出良好的临床效果,可有效改善皮肤整体状况和生活质量,同时表现出较高的安全性,适宜在临床上推广应用。

表达非洲猪瘟病毒p72蛋白重组猪痘病毒的构建及鉴定

【目的】旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,为探索猪痘病毒(SPV)作为非洲猪瘟新型活疫苗载体的可行性。【方法】本研究优化合成非洲猪瘟病毒B646L基因,克隆至重组猪痘病毒通用转移载体pUSG11/P28,构建重组转移质粒pUSG11/P28-B646L,经脂质体介导转染预先感染猪痘病毒的PK15细胞,出现病变后通过绿色荧光标记筛选和纯化重组病毒。拯救的重组病毒经PCR和基因测序鉴定后,通过Western blotting和间接免疫荧光试验检测p72蛋白的表达情况,并测定重组病毒的增殖特性和遗传稳定性。【结果】重组转移质粒pUSG11/P28-B646L在PK15细胞内和SPV成功进行了同源重组,纯化得到的重组病毒含有B646L基因,且基因序列正确。Western blotting和间接免疫荧光试验结果表明,重组病毒rSPV-B646L在PK15细胞中能表达非洲猪瘟病毒p72蛋白,表达的蛋白大小正确,且能与p72单克隆抗体发生特异性反应。一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性没有明显差异。重组病毒在PK15细胞上连续传15代后,插入的外源基因没有发生突变或缺失。【结论】研究以SPV为载体,成功构建了正确表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,重组病毒在PK15细胞中有良好的遗传稳定性,B646L基因的插入没有影响重组病毒在PK15细胞上的增殖能力,表达的p72蛋白具有反应原性。研究成果为非洲猪瘟多基因重组猪痘病毒载体疫苗的研发提供依据。

重组贻贝粘蛋白改善面部敏感性皮肤临床疗效及安全性探讨

研究重组贻贝粘蛋白在面部敏感性皮肤治疗中的临床疗效及安全性。方法 选取2022年9月-2023年9月凉山州第一人民医院确诊的79例面部敏感性皮肤为研究对象,使用随机数字表法分为两组,使用重组贻贝粘蛋白凝胶的40例患者纳入的干预组,使用该产品凝胶基质的39例患者纳入对照组,治疗4周后,比较两组症状改善效果、红区数值、弹性、光泽度、皮肤病生活质量评分及不良反应。结果 治疗后,干预组与对照组相比,症状改善VAS评分下降更多,15min即刻改善症状;皮肤光泽度、弹性评分更高,面部红斑面积减少更加明显;患者生活综合质量有更为明显的提升,差异具有统计学意义。结论 在面部敏感性皮肤的临床治疗中,重组贻贝粘蛋白可即刻改善患者各种面部不适症状,提高患者生活质量,安全性和有效性可靠,值得临床推广使用。

重组贻贝粘蛋白水凝胶敷料在点阵CO2激光治疗痤疮凹陷性瘢痕后的疗效和安全性评价

观察点阵CO2激光术后联合重组贻贝粘蛋白水凝胶敷料疗效及安全性。方法 选取2022 年9月—2023年9月来我院皮肤科室治疗痤疮凹陷性瘢痕的患者60例,采用双盲数字法将其平均分为研究组30例和对照组30例,其中对照组患者使用点阵CO2激光治疗,研究组患者在采用点阵CO2激光的基础上联合重组贻贝粘蛋白水凝胶敷料治疗。治疗28d后对两组患者临床疗效、瘢痕皮损、面部红斑量、经表皮水分流失量、临床痤疮瘢痕情况(ECCA评分量表)、面部整体美学效果改善情况(GAIS评分量表)和治疗期间的安全性进行对比。结果 治疗28d后研究组患者的临床总治疗有效率明显高于对照组(93.33% vs 63.33%),差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,研究组患者的急性炎症反应半定量评分明显低于对照组(1.53±0.37 vs 2.16±0.28),而平均脱痂时间明显短于对照组(6.34±1.36d vs 8.27±1.86d),差异有统计学意义(P<0.05);治疗后两组患者的ECCA权重评分较治疗前均显著降低,而两组患者的GAIS评分较治疗前显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05),其中研究组患者相较于对照组患者而言ECCA降低更多(15.78±5.28 vs 23.62±6.29),而GAIS升高更多(2.57±0.61 vs 2.13±0.56) ,差异具有统计学意义(P<0.05);两组不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 重组贻贝粘蛋白水凝胶敷料联合点阵CO2激光治疗痤疮凹陷性瘢痕疗效确切,可减少点阵CO2激光术不良反应,缩短恢复期,提高皮肤屏障功能与美观度。

济麦44/济麦229重组自交系群体籽粒蛋白质含量QTL分析

小麦籽粒蛋白质含量与面团流变学特性及加工特性的关系密不可分。本研究在2020—2021年济南试验基地(E1)及2021—2022年济南试验基地(E2)和济阳试验基地(E3)三个环境下,以“济麦44×济麦229”构建的包含285个家系的重组自交系群体(F2∶6RILs)为材料,利用小麦55K SNP芯片构建高密度遗传连锁图谱,对籽粒蛋白质含量进行QTL分析。结果共筛选到2344个SNP标记用于构建遗传连锁图谱,图谱总长度3349.95 cM,平均标记密度为1.43 cM/标记。通过对籽粒蛋白质含量的QTL分析,共检测到18个籽粒蛋白质含量相关QTL,分布在1A、1B、2B、3D、4B、4D、5A、5B、5D、7A、7B共11条染色体上。Qpc.saas.4B-1在E1、E2和E3三个环境和BLUE(最佳线性无偏估计)值中均被稳定检测到,可以解释3.26%~23.79%的表型变异。Qpc.saas.4D和Qpc.saas.5A在两个环境和BLUE值中被检测到,分别解释2.42%~11.18%和2.48%~5.47%的表型变异,且Qpc.saas.4D与小麦矮秆基因Rht-D1b物理位置重合。本研究中检测到的QTL新位点Qpc.saas.4B-1、Qpc.saas.4D和Qpc.saas.5A是控制籽粒蛋白质含量的主效基因,具有高表型变异解释率。本研究结果可为小麦品质育种提供分子标记及理论参考。

重组牛乳过敏原β-乳球蛋白的可溶性表达及其特性分析

目的实现β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)的可溶性表达,并比较重组BLG和天然BLG在结构和免疫原性两个方面的差异性。方法将pET-30a-BLG重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行体外诱导表达,并对表达条件进行优化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳方法分析重组蛋白的可溶性。利用荧光光谱和圆二色谱比较重组BLG空间结构变化,同时采用竞争抑制酶联免疫吸附实验评价重组BLG致敏性能力。结果在Tris-HCl溶液体系中重组BLG的可溶性表达可达到50%以上,可溶性表达的最优条件为:在Tris-HCl溶液体系中,诱导温度为37℃,IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导4 h。重组BLG表面疏水性下降,可溶性重组BLG的α-螺旋结构减少,经除盐处理后致敏性下降,包涵体重组BLG无规则卷曲结构减少、致敏性上升。结论本研究成功从上清液中纯化得到可溶性重组BLG,且可溶性表达获得的BLG空间结构更接近天然蛋白。

补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响

背景:胶原蛋白是含量最为丰富的胞外基质成分,与骨骼肌细胞外基质的结构、功能密切相关,但补充由生物工程技术生产的重组人源胶原蛋白(recombinant human collagen,rhC)对骨骼肌细胞外基质的影响及机制尚不清楚。目的:探讨补充rhC对离心运动后骨骼肌细胞外基质重塑的影响及作用机制。方法:将104只8周龄健康雄性C57小鼠随机分为对照组(生理盐水)、rhC低剂量组(0.2 g/kg)、中剂量组(1.0 g/kg)和高剂量组(2.0 g/kg),连续7 d灌胃干预后每组选取2只小鼠,解剖各脏器进行苏木精-伊红染色判断炎性浸润情况,其余小鼠于第8天进行离心运动,分别在离心运动后即刻(0),24,48,96 h观察细胞外基质结构变化,检测小鼠抓握力、血清肌酸激酶活性、骨骼肌组织基质金属蛋白酶2,9,14和基质金属蛋白酶抑制剂2的蛋白水平。结果与结论:①苏木精-伊红染色观察短期补充rhC对心脏、肝脏、脾、肾无显著影响;②一次性离心运动后,rhC中、高剂量组小鼠抓握力恢复率显著升高(P<0.01);③各组肌酸激酶变化趋势一致,组间无显著性差异;④rhC低剂量组细胞外基质恢复进程快于对照组,rhC中、高剂量组肌束膜较为完整;⑤rhC高剂量组基质金属蛋白酶9蛋白水平显著降低(P<0.05);⑥rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶14蛋白水平显著降低(P<0.05);⑦rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶2蛋白水平显著降低(P<0.05);⑧rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白水平显著升高(P<0.05);⑨rhC各剂量组基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶抑制剂2比值显著降低(P<0.05)。该研究发现连续7 d预补充1.0,2.0 g/kg rhC可通过调节基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂来抑制运动后骨骼肌细胞外基质降解,从而促进小鼠骨骼肌力量恢复。

重组荔枝类甜蛋白的高效表达、纯化及活性鉴定

荔枝类甜蛋白(litchi thaumatin-like protein,LcTLP)是导致部分人群过量食用荔枝引起机体炎症反应的主要原因之一,为深入探究其引起的机体炎症机制,揭示其晶体结构与促炎活性位点等生物学特性,需获得大量高纯度LcTLP。然而现有报道中鲜见大量获取高纯度可溶性LcTLP的提取方法,因此该研究对LcTLP基因进行密码子优化后构建了表达载体pCold-NusA-LcTLP,并成功表达了可溶重组蛋白NusA-LcTLP。通过亲和层析与凝胶过滤层析两步纯化法,最终得到的重组蛋白产量可达36.26 mg/L,纯度达90%以上,表明该纯化方案可高效制得高纯度重组LcTLP。经RAW264.7细胞炎症活性验证,重组LcTLP在1、2μg/mL时刺激细胞NO分泌量分别为12.75、14.68μmol/L,为空白组的2.91、3.36倍,验证了重组LcTLP具有一定的促炎活性。该表达载体与纯化方案高效表达得到了可溶性重组LcTLP,为后续深入研究LcTLP在细胞生命活动中的功能机制奠定了基础。

人白细胞介素-6重组蛋白的制备

目的利用大肠杆菌原核表达系统制备人白细胞介素-6(IL-6)重组蛋白,并对蛋白进行纯化,为后期制备IL-6标准物质和质控品提供候选物质基础。方法以现有IL-6原核表达质粒6His-IL-6-pET-28a(+)为模板,通过PCR扩增目的片段,并在其N端添加His标签。通过酶切连接的方式,将该段基因克隆至pRSFDuet载体,随后转化BL21感受肽获得表达菌株。利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导,得到IL-6重组蛋白,利用镍柱亲和层析技术对蛋白进行纯化,并比对两个表达菌株的蛋白表达量,选择高表达菌株进行后续实验。结果成功构建6His-IL-6-pRSFDuet原核表达质粒,根据蛋白表达比对情况选择6His-IL-6-pET-28a(+)质粒进行后续实验,确定最适IPTG诱导浓度(0.2 mmol/L)、诱导温度(20℃)、诱导时间(20 h)等条件,在BL21中高效表达重组IL-6蛋白,纯化后的蛋白不仅可通过临床检测,且稀释倍数与检测结果之间呈线性关系。结论成功获得低成本、高浓度、高纯度的IL-6重组蛋白,为后续IL-6标准物质和质控品的制备奠定了基础。

猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

重组SARS-CoV-2 Omicron变异株S1蛋白的表达及免疫原性评价

目的构建表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Omicron BA.1变异株S1蛋白的真核表达载体,在CHO-K1细胞中进行表达,评价其免疫原性,并对佐剂和抗原剂量进行研究。方法构建重组质粒UCOE-Omi-S1,转染至CHO-K1工程细胞中进行表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blot法实验鉴定重组S1蛋白。将BALB/c小鼠随机分为12组,即PBS组,无佐剂组(高、中、低剂量组),铝盐佐剂对照组,MF59佐剂对照组,铝盐佐剂实验组(高、中、低剂量组),MF59佐剂实验组(高、中、低剂量组),将按照分组要求配比的溶液经小鼠肌内注射3次,间隔14天,每2周尾静脉采血,末次免疫30天后取血分离血清,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清抗体水平,并和SARS-CoV-2原型株的假病毒和SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株的假病毒进行假病毒中和实验。结果目的蛋白在CHO-K1工程细胞表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为70kDa处可见1条特异性蛋白表达条带,经Western blot法鉴定为Omi-S1蛋白。铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果优于无佐剂组,铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果相差不大,但MF59佐剂起效快;高、中、低剂量组的免疫诱导效果在第8周相差不大,但高剂量组起效快。假病毒中和实验表明,MF59佐剂实验组针对Omicron变异株的中和抗体水平高于铝盐佐剂组。结论本研究所构建的Omicron S1重组蛋白免疫原性良好,在小鼠体内产生了良好的体液免疫应答,并诱导高水平的对抗SARS-CoV-2假病毒的中和抗体,对佐剂和抗原剂量初步研究,结果显示,10μg以下抗原剂量搭配MF59佐剂可获得较好的免疫效果。本研究为SARS-CoV-2变异株的重组蛋白疫苗的研制提供了实验基础。

外源性重组膜联蛋白A6对小鼠离心运动后骨骼肌早期质膜损伤修复的影响

目的:探究外源性重组人源膜联蛋白A6(recombinant human Annexin A6,rhANX A6)干预对离心运动损伤模型小鼠骨骼肌早期质膜损伤的影响及其代谢特点。方法:将56只8周龄C57雄性小鼠随机分为安静对照组(C)、运动注射磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)组(EP)和运动注射rhANX A6组(ER),其中运动组根据运动后不同取材时间点分为EP2、EP6、EP12和ER2、ER6、ER12,每组各8只。运动前2h根据小鼠体重对EP组和ER组分别腹腔注射1倍浓度PBS缓冲液和rhANX A6(0.8mg/kg)。运用ELISA检测各组小鼠血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)、膜联蛋白A6(Annexin A6,ANX A6)及骨骼肌中ANX A6的含量,运用伊文思蓝染色(Evans blue dye,EBD)观察各组小鼠骨骼肌质膜的损伤情况。结果:(1)EP组各时相、ER12h血清CK活力值显著高于C组(P<0.01);同一时间点对比,EP组各时相均显著高于ER组(P<0.05)。(2)EP组及ER组各时相EBD阳性区域平均荧光强度均显著高于C组(P<0.01);EP组各时相均显著高于ER组(P<0.01)。(3)ER组各时相及EP6h、EP12h血清ANX A6含量显著高于C组(P<0.01);12h时相ER组显著高于EP组(P<0.05)。(4)ER组及EP组各时相骨骼肌ANX A6显著高于C组(P<0.05);ER组各时相均显著高于EP组(P<0.05)。结论:小鼠离心运动前2h注射外源性rhANX A6可显著改善运动后骨骼肌早期质膜损伤,推测rhANX A6直接参与了离心运动诱导的骨骼肌早期质膜损伤修复。