检测人TCR BD基因重排时RSS断裂末端的LM-PCR方法的建立

目的:建立检测人T细胞TCRBD基因(Diversity Gene)经历重排的连接介导PCR方法(Ligation Mediate dPCR,LMPCR),为T细胞重排和疾病的关系研究提供基础。方法:在人TCRβ链BD1与BD25′端重组信号序列(RSS)前,BD1与BD23′端RSS后各设计两套用于巢式PCR引物;设计并合成和双链RSS平断裂末端相接的特殊接头(BWLinker),提取胸腺组织、正常人和急性T淋巴细胞白血病(TALL)外周血单个核细胞(PBMC)样本总DNA,和BWlinker连接,进行巢式PCR,PCR产物琼脂糖电泳分析,阳性产物做胶回收,并克隆测序鉴定。结果:在1例胸腺组织提取的总DNA中证实存在BD1和BD25′和3′的RSS断裂末端,在2例TALLs的PBMC中检测到BD25′和3′的RSS断裂末端,2例正常人PBMC中未能检测到RSS断裂末端,阳性的LMPCR产物通过测序鉴定,和基因组中序列完全相符合。结论:1例胸腺组织和2例TALL的PBMC中检测到RSS断裂末端,提示TCRBD基因正经历重排,测序结果表明建立的监测TCR重排的LMPCR方法可靠,可用于T细胞重排模型和相关疾病的机制研究。

牛胚系基因中两种JH和Cμ抗体基因的克隆与分析

根据NCBIGenBankTM中登录的2个牛抗体重链可变区J基因(JH)(序列号为AY158087,AY149283)的序列不同之处设计PCR引物,能从同一个体的Holstein牛基因组DNA中扩增得到与以上2个基因分别相同的序列,证明这2个JH基因的差异不是由于牛个体或品种不同引起的.提取牛脾脏总RNA,RT-PCR扩增IgMcDNA,测序结果显示:序列号为AY149283的JH基因中第六外显子JH6是一个功能基因,它可以编码牛IgM的部分CDR3区和完整的FR4区,从2种IgMcDNA克隆的测序结果可以看出,其恒定区序列分别与序列号为U63637和AY230207的2种抗体重链恒定区μ基因(Cμ)cDNA序列相同.PCR扩增JH-Cμ序列,测序结果表明:序列号为AY158087的JH基因是同以上2种Cμ基因分别串连在一起的(序列号分别为AY230207和U63637).以上结果证明:序列号为U63637和AY230207的2个Cμ基因分别与AY149283的JH基因串联在一起,都能够参与牛IgM的产生,它们与AY158087的JH基因共同存在于同一个体Holstein牛胚系基因中.

RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及分子机制

目的探讨重组信号序列结合蛋白J(RBPJ)-微小核糖核酸155(miR155)-核转录因子-κB(NF-κB)-缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中的调控作用及分子机制。方法60只成年大鼠随机均分为假手术(sham)组(仅分离并暴露颈部血管,不插线栓)和实验组(采用线栓法建立脑缺血-再灌注损伤模型),采用Longa评分评估术后神经功能损伤;0.3 mL/100 g水合氯醛腹腔麻醉大鼠后断头取脑,分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法检测2组大鼠脑组织中RBPJ、miR155、HIF-1α及NF-κB mRNA和蛋白的表达,采用双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀测序miR155与HIF-1α、RBPJ及NF-κB的相互作用位点;采用基因沉默技术干扰RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后,用酶联免疫吸附实验检测2组大鼠脑组织样本中TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)及IL-6相关炎性因子的表达;取新生24 h内SD乳鼠10只,采用75%乙醇浸泡消毒后取脑海马组织消化培养神经元细胞,采用慢病毒转染基因沉默技术在细胞层面验证RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路的相关性。结果与sham组比较,实验组大鼠出现明显的神经功能损伤(P<0.05),脑梗死面积大于sham组(P<0.05);sham组大鼠脑组织中miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表达水平均低于实验组(P<0.05);沉默RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效应分子中的1种,该通路中其他分子表达均降低(P<0.05);miR155与HIF-1α之间的结合位点为E-box CANNTG,miR155与NF-κB之间的结合位点为AC-CAAAG,双荧光素酶报告提示miR155与NF-κB3′UTR进行结合;抑制RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后,TNF-α、IL-1β及IL-6表达下降(P<0.05)。结论RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中起着重要的负性调控作用,其机制可能与该通路相关因子miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的相互影响和炎症因子的表达有关。

RSSs的组成和特征对体细胞V(D)J基因重排效率的影响

T/B细胞的多样性源于V(D)J基因片段重排,重排所形成的TCR/BCR组库中,各V(D)J基因的表达频率与其在初始重组中的利用、自身耐受过程中的选择、克隆增生中的应答相关,但V(D)J基因在初始重组中利用效率差异的研究较少。影响V(D)J基因重排利用的因素和机制复杂,重组信号序列(RSSs)的heptamer、nonamer、spacer的组成和特征发挥重要作用。本文将对保守与改变的RSSs对体细胞重排V(D)J基因利用效率的影响进行综述。

Notch信号与卡波西肉瘤相关疱疹病毒关系的研究进展

卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)是卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma,KS)等肿瘤的病因。一系列研究显示KSHV病毒基因与Notch信号通路分子的交互作用在调控KSHV复制以及促进肿瘤发生中发挥了重要作用。Notch信号传导通路由配体、受体、转录因子、效应分子等组成,相邻细胞间通过Notch信号调节细胞分化、增殖和凋亡、器官形成和形态发生等过程。本文就KSHV对Notch信号的调控以及Notch信号在KSHV复制及肿瘤形成中的作用作一综述。