注射用聚乙二醇化重组假丝酵母尿酸氧化酶中有机溶剂残留量顶空气相色谱检测方法的建立及验证

目的 建立注射用聚乙二醇化重组假丝酵母尿酸氧化酶SSS111中异丙醇(isopropanol,IPA)、二氯甲烷(dichloromethane,DCM)和甲苯(toluene,TOL)残留量的顶空气相色谱检测方法,并进行验证。方法 采用DB-1301毛细管柱(30 m×0.53 mm,1.0μm)。检测温度:250℃,进样温度:200℃,载气:氮气,分流比:3,柱流速:3.0 mL/min,氢气流速:60 mL/min,空气流速:400 mL/min。柱温采用程序升温,初始柱温:50℃,维持12 min,以40℃/min的速度升温至200℃,维持5 min。顶空瓶的平衡温度:120℃,平衡时间:20 min。验证方法的线性范围、精密性、准确性,确定检测限和定量限。采用建立的方法检测3批SSS111供试品中IPA、DCM和TOL的残留量。结果 IPA、DCM、TOL分别为0.001 982~7.928、0.002 118~8.472和0.041 960~8.392μg/mL时,与峰面积呈良好的线性关系,r均> 0.99;重复6次检测对照品溶液中IPA、DCM、TOL残留量的RSD均<5%;SSS111供试品中添加对照品溶液后检测IPA、DCM、TOL回收率均在80%~120%范围内;IPA、DCM、TOL的检测限分别为1.982、2.118、41.96 ng/mL,定量限分别为6.941、6.236、126.92 ng/mL。3批供试品溶液中的IPA残留量均低于检测限,DCM残留量约为1 ppm,TOL均<1 ppm。结论 建立的顶空气相色谱检测法具有良好的精密性、准确性,且操作简便,灵敏度较高,可用于SSS111中有机溶剂残留量的检测。

液质联用法分析重组假丝酵母尿酸氧化酶的二硫键

目的采用液质联用法分析重组假丝酵母尿酸氧化酶的二硫键数量及存在方式。方法将重组假丝酵母尿酸氧化酶分别进行烷基化及变性后烷基化处理,液质联用法测定未处理及两种不同方法处理后的尿酸氧化酶的平均相对分子质量,根据测定结果判断其二硫键数量及存在方式。结果未处理样品的平均相对分子质量为34 076.80,表明该蛋白以单体形式存在,不存在链间二硫键;直接烷基化样品平均相对分子质量为34 133.40,仅有一个游离巯基被烷基化;变性后烷基化样品的平均相对分子质量为34 304.80,4个游离巯基全被烷基化,蛋白不存在链内二硫键。结论重组假丝酵母尿酸氧化酶中的4个半胱氨酸未形成链间及链内二硫键。

重组假丝酵母尿酸氧化酶等电点毛细管等电聚焦检测方法的建立及验证

目的建立检测重组假丝酵母尿酸氧化酶等电点(isoelectric point,pI)的毛细管等点聚焦(capillary isoelectrie focusing,cIEF)方法,并进行验证。方法通过优化cIEF过程中稳定剂比例、聚焦时间等参数,建立cIEF方法,并对方法的专属性、精密度、准确性、耐用性进行验证。结果确定稳定剂精氨酸(arginine,ARG)︰亚氨基二乙酸(iminodiacetic acid,IDA)比例60μL︰6μL,聚焦时间15 min为最适条件。样品基质在重组假丝酵母尿酸氧化酶主峰位置无干扰峰;重复性、中间精密度、批间精密度验证相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.81%~0.87%、0.91%~1.5%和0%~0.79%;3-10两性电解质载体、cIEF凝胶、毛细管柱等物料批号改变,方法不受影响。结论建立的cIEF方法专属性、精密度、准确度、耐用性良好,适用于重组假丝酵母尿酸氧化酶pI的检测。

雌激素诱导白假丝酵母菌阴道炎小鼠模型中环氧化酶-2的表达

目的:探讨雌激素对白假丝酵母菌性阴道炎模型小鼠阴道组织中环氧化酶-2(COX-2)表达的影响及其在发病机制中的意义。方法:80只小鼠随机分为雌激素化未感染白假丝酵母菌组(E组)、未雌激素化感染白假丝酵母菌组(I组)、雌激素化感染白假丝酵母菌组(EI组)和空白对照组(C组)。制作白念珠菌性阴道炎小鼠模型,每组分别于接种后第2天、第4天、第7天和第14天取小鼠阴道组织,用免疫组化方法检测组织中COX-2的表达。结果:除C组外,各组小鼠阴道组织内第2天出现COX-2的阳性表达,持续升高至第7天达到高峰,第14天时开始下降;E组在第4、第7天COX-2免疫组化检测OD值分别为0.157±0.017和0.161±0.014,与相应C组(0.101±0.014和0.106±0.014)比较均具有显著性统计学差异(P均<0.05)。EI和I组第7天的OD值分别达到0.275±0.059和0.234±0.063,与对照组相比明显上调(P均<0.01),且EI组显著高于I组(P<0.05)。结论:在白假丝酵母菌性阴道炎小鼠模型中,雌激素能通过诱导阴道组织中COX-2的表达在其发病机制中起重要作用。

H_2O_2对热带假丝酵母醇氧化酶的影响及其作用机理分析

考察了H2 O2 对热带假丝酵母代谢烷烃生产二元酸过程中醇氧化酶 (fattyalcoholoxidase ,AOX)的影响。研究表明 :2mmol L和 5mmol L的H2 O2 对AOX的比酶活有明显的促进作用 ,分别比对照提高了 68 2 %和 82 9%。研究还发现 ,H2 O2 是以超氧阴离子自由基等形式在胞内存在 ,并对H2 O2 在代谢过程中的作用机理进行了分析。

热带假丝酵母酰基辅酶A氧化酶的纯化及性质研究

利用热带假丝酵母由烷烃生产二元酸时 ,二元酸面临被 β氧化降解的代谢途径。酰基辅酶A氧化酶是二元酸 β氧化的限速酶。以热带假丝酵母 1 2 3 0菌株为材料 ,经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析、Blue Sepharose亲和柱层析 ,得到电泳均一的酰基辅酶A氧化酶。该酶有两种亚基 ,分子量分别为 74kD和 78kD。酶作用最适pH和最适温度分别为 8 0和5 0℃。金属离子Ag+ 、Pb2 + 完全抑制酶活性 ,Ba2 + 、Mg2 + 、Ca2 + 对酶活性有明显抑制作用。丙烯酸是酶的反竞争性抑制剂 ,Ki 为 0 6 3 3mmol L ,维生素C是竞争性抑制剂 ,Ki 为 2 0 1× 1 0 - 3mmol L。

脂肪醇氧化酶基因缺失对热带假丝酵母生理功能的影响

为考察热带假丝酵母(Candida tropicalis)脂肪醇氧化酶(FAO)基因缺失对菌株自身的影响,利用同源重组的方法敲除或回补FAO1和FAO2基因,研究突变株的生长情况和胞内脂肪醇氧化酶活性变化,并进一步评价细胞利用烷烃合成脂肪醇的能力。结果表明:成功构建了基因缺失突变株FTYT(ΔFAO11/ΔFAO12)、2aT2bT(ΔFAO2a/ΔFAO2b)、F3YT(ΔFAO11/ΔFAO12ΔFAO2a/ΔFAO2b)和基因回补菌株UCF1和UCF2。在以葡萄糖为碳源的培养基中,各菌株的生长情况没有显著差异;在以烷烃(C12~C14)为碳源的培养基中,FTYT菌株生长速度快于其他菌株,F3YT菌株的生长速度显著受到抑制,表明组合删除FAO1和FAO2基因降低了细胞对烷烃的利用,影响了细胞生长。与出发菌株相比,同时删除FAO1和FAO2基因后突变株能够转化烷烃合成正十二烷醇,摇瓶发酵水平达到59.63 mg/L,是出发菌株的近460倍。FAO1和FAO2基因在细胞利用烷烃中有重要作用且功能存在差异,并且可以作为代谢工程改造热带假丝酵母生产脂肪醇的潜在靶点。

产朊假丝酵母尿酸酶的快速提取法及产酶最适条件

利用表面活性剂及还原剂处理产朊假丝酵母(Candida utilis)细胞,在培养液pH7—11范围内,可使C.utilis产生的尿酸酶快速地释放到胞外。当Triton X-100及巯基乙醇浓度为0.1%,培养液pH为8时,获得的最高酶活性为4.78u/g湿菌体,最适pH值为8—9,处理时间为4小时。利用该方法获得的最高酶活性高于一般常规处理方法,即超声波法及透析法,它们的酶活性分别为1.9u/g湿菌体及0.76u/g湿菌体。

热带假丝酵母肉毒碱乙酰转移酶酶活测定及重组菌的性质

建立了快速部分提纯和测定热带假丝酵母中肉毒碱乙酰转移酶 (carnitine acetyltransferase, CAT) 酶活的方法. 并考察了重组热带假丝酵母的CAT酶活、产酸能力及烷烃转化率. 结果表明, 重组菌的 CAT酶活比原始菌降低了45%, 胞内二元酸通过β 氧化的无益消耗得到有效抑制. 相应地, 重组菌的产酸能力和烷烃转化率分别提高了11%和12%.

假丝酵母尿酸酶形成条件

选出了一株产尿酸酶的产朊假丝酵母(candida utilis)AS2.117。此菌株尿酸酶形成条件的研究表明:尿酸、黄嘌呤和鸟嘌呤对酶形成起诱导作用;玉米浆对菌株生长和酶形成起十分重要的作用;蔗糖、葡萄糖、D-甘露糖和果糖是酶形成的适合碳源;生物素对酶产生有促进作用;在含有玉米浆培养基中加入无机氮源对产酶无作用,添加有机氮略增加产酶量。尿酸酶形成最适培养基组成为(%):蔗糖5,玉米浆3,尿酸0.1,蛋白胨0.1,生物素0.05,KCl0.1,NaCl 0.1。最适pH为6.2。在250ml三角瓶中装30ml培养基为最适。在200r/min的旋转摇床上25℃振荡培养21h,在此条件下最终酶活力可达0.6u/ml。

产朊假丝酵母菌的筛选及其尿酸酶活力分析

用以尿酸作为唯一碳源的YNB培养基初步筛选出两株产朊假丝酵母,并将筛选出的产朊假丝酵母分别用两种培养基对两株菌进行培养,并比较了两种培养基的培养效果,优化了培养条件;从发酵液中分离纯化尿酸酶,并对尿酸酶活力进行测定,改进了测定方法.结果发现,YNB培养基比酵母膏培养基更适合培养所筛选的产朊假丝酵母;两株菌所产尿酸酶有较高活力.

重组人干扰素α-2b阴道泡腾胶囊配伍克霉唑阴道片治疗外阴阴道假丝酵母菌病临床观察

外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC）是由假丝酵母菌感染引起的外阴阴道炎症,是妇科常见病。主要病原体为白假丝酵母菌,占80%～90%,少数为非白色假丝酵母菌。疾病特点是经治疗即愈,但治疗后极易复发。为此探求一种既能缓解外阴阴道假丝酵母菌病的临床症状,

产朊假丝酵母尿酸酶药用性分析

尿酸作为嘌呤分解终产物主要通过肾脏排泄,血清尿酸的水平是肾脏功能监测的有效指标。尿酸酶可专一催化氧化尿酸生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢,从而广泛用于临床检验领域测定血清尿酸。本文初步探讨产朊假丝酵母尿酸酶的特性,为通过分子改造获得理想的药用尿酸酶进行理论性铺垫。

产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌尿酸酶特性的比较

目的探讨产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的特性。方法复苏、培养新购进菌株以制备尿酸酶,利用硫酸铵分级沉淀法、DEAE纤维素52层析和制备PAGE纯化尿酸酶,测定纯化的尿酸酶的活力、表征,并分析其亚基构成。结果两种尿酸酶分子均为同四聚体,产朊假丝酵母尿酸酶的单肽链分子量和天然酶分子量分别为33.0 ku和134.0 ku,其最适pH值接近8.8,在pH7.4时可保留50%以上活性,该酶的米氏常数(Km)为(32.8±3.1)μmol/L(n=10),黄嘌呤的抑制常数为(4.8±0.2)μmol/L(n=3);而苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶则分别为35.7 ku和151.0 ku,最适pH大于9.0,pH7.4时酶活性保留不到30%,其Km为(204±14)μmol/L(n=8),黄嘌呤的抑制常数为(41±7)μmol/L(n=5)。结论该研究对构建杂合药用尿酸酶以治疗高尿酸血症相关疾病具有一定的理论意义。

产朊假丝酵母尿酸酶的纯化和特性研究

产朊假丝酵母尿酸酶经2次DEAE-cellulose 52层析后比活性提高20倍以上,SDS-PAGE分析发现其含一种约33.0 kD多肽,Sephadex G-200层析发现此天然尿酸酶分子量约134.0 kD.MALDI-TOF-MS分析比活性>7.0 U/mg样品没有检测到单一肽链,而丰度最高成分为67.7 kD,次高成分为131.4 kD.此酶最适pH值接近8.8,在pH 7.4时可保留50%以上活性,37℃时4 h内稳定,米氏常数为(32.8±3.1)μmol/L(n=10),黄嘌呤的抑制常数为(4.8±0.2)μmol/L(n=3);用蒸馏水透析后失活90%以上,且随后加NaCl处理后酶活性不能恢复.Cu2+和Fe3+在1.0 mmol/L时对此酶有明显抑制作用.这些结果表明此尿酸酶需通过分子工程改造才能用作治疗高尿酸血症相关疾病的药物.

长期高盐刺激诱导白假丝酵母菌耐受氧化应激

目的观察长期高浓度氯化钠刺激对白假丝酵母菌耐受氧化应激能力的影响。方法选用2株白假丝酵母菌国际标准株SC5314和ATCC76615,用含有1mol/L氯化钠的YEPD培养液连续培养24d,考察子代与亲本菌对氧化应激的耐受能力。采用real-time RT-PCR考察白假丝酵母菌抗氧化酶的转录水平,并测定其抗氧化酶的活性,利用丙二醛(MDA)测定试剂盒衡量白假丝酵母菌脂质过氧化损伤,并测量白假丝酵母菌菌体细胞内活性氧水平。结果长期用高浓度氯化钠刺激能增加白假丝酵母菌对过氧化氢(12mmol/L)和咪康唑(4μg/ml)的耐受性,促进其抗氧化酶的转录,使抗氧化酶SOD1、CAT1、谷胱甘肽还原酶(GR,转录基因为TTR1)的转录水平升高2～5倍,增强抗氧化酶的活性(P<0.05),降低脂质过氧化损伤(P<0.01),减少菌体细胞内活性氧水平(P<0.001)。结论长期高浓度氯化钠刺激能够增强白假丝酵母菌耐受氧化应激的能力。

白假丝酵母脂肪酶CaLIP5在毕赤酵母X33中的优化重组表达

[目的]研究新的脂肪酶及优化脂肪酶发酵培养条件。[方法]在毕赤酵母X33系统中重组表达白假丝酵母脂肪酶CaLIP5。利用响应面分析法,构建了CaLIP5的酶活回归方程。[结果]由响应面分析可知,在温度25.71℃,pH8.33,酵母提取物浓度1.28%和葡萄糖浓度4.06%时,预测最大酶活为8.33U/ml。试验验证酶活为9.24U/ml。实际试验值与模型预测值基本一致。优化后的酶活提高了22.22%。[结论]在优化的培养条件下,可以获得毕赤酵母X33重组表达CaLIP5的最大酶活。

重组人干扰素α2b栓联合硝夫太尔制霉菌素软胶囊治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病的临床研究

目的探讨重组人干扰素α2b栓联合硝夫太尔制霉菌素软胶囊治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病的效果。方法选择2015年5月~2016年4月我院收治复发性外阴阴道假丝酵母菌病120例,按照随机数字表法分为观察组和对照组,各60例。对照组采用硝夫太尔制霉菌素软胶囊联合氟康唑分散片治疗;观察组采用重组人干扰素α2b栓联合硝夫太尔制霉菌素软胶囊治疗,观察两组治疗效果。结果观察组和对照组的总有效率分别为96.7%和71.7%,观察组优于对照组(P<0.05);观察组和对照组不良反应发生率分别为1.7%和11.7%,组间比较,差异有统计学意义(P<0.05);观察组停药3、6个月后的复发率(0、3.3%)均明显低于对照组(10.0%、25.0%)(P<0.05)。结论重组人干扰素α2b栓联合硝夫太尔制霉菌素软胶囊治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病有助于提高治疗效果,降低不良反应和复发率,疗效显著。

重组人干扰素α-2b阴道泡腾胶囊联合伊曲康唑治疗外阴阴道假丝酵母菌病54例

目的观察重组人干扰素α-2b阴道泡腾胶囊联合伊曲康唑治疗外阴阴道假丝酵母菌病的疗效。方法门诊确诊为外阴阴道假丝酵母菌病患者106例,随机分为2组:研究组54例,用重组人干扰素α-2b阴道泡腾胶囊外用及伊曲康唑口服联合治疗;对照组52例,采用口服伊曲康唑治疗。两组患者于疗程结束后1周及治疗开始后第1、2、3个月来院随诊,比较两组治疗结束后1周的痊愈率及3个月时的总复发率。结果疗程结束后1周研究组的痊愈率为94.4%,对照组为90.4%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后3个月研究组的总复发率为5.6%,明显低于对照组的28.8%(P<0.01)。结论重组人干扰素α-2b阴道泡腾胶囊联合伊曲康唑治疗外阴阴道假丝酵母菌病疗效好,复发率低。

重组人干扰素α-2b栓联合氟康唑治疗外阴阴道假丝酵母菌病的效果

目的分析重组人干扰素α-2b栓联合氟康唑治疗外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者的效果。方法选取2018年3月至2019年5月漯河市临颍县第二人民医院VVC患者78例,按照随机数表法化分组。对照组(39例)接受氟康唑治疗,联合组(39例)接受重组人干扰素α-2b栓+氟康唑治疗。采用4级赋分法评估两组治疗前、治疗4周后症状(外阴瘙痒、白带异常、阴道充血)改善情况,对比两组疗效、复发率及炎症因子[血清白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平。结果联合组总有效率(94.87%)高于对照组(76.92%,P<0.05);联合组治疗4周后外阴瘙痒、白带异常及阴道充血评分低于对照组(P<0.05);联合组治疗4周后血清IL-10、TNF-α水平低于对照组(P<0.05);随访6个月,两组复发率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组人干扰素α-2b栓联合氟康唑治疗VVC,效果显著,能有效缓解症状,减轻炎症反应,且复发率低。