9ku颗粒溶素活性肽重组减毒沙门菌的构建与表达

目的构建人9ku颗粒溶素(granulysin)的重组减毒沙门菌,并在真核细胞中表达,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR、双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌;重组质粒电转化减毒沙门菌后,将重组菌感染巨噬细胞,以RT-PCR检查颗粒溶素的表达。结果成功扩增出含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9ku颗粒溶素;重组减毒沙门菌感染细胞后,检测到颗粒溶素的表达。结论成功构建含9ku颗粒溶素活性肽基因的重组减毒沙门菌,该菌能成功递呈携带基因在感染细胞内表达。

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。

携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门菌诱导山羊免疫应答研究

为探讨携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门菌诱导山羊免疫应答效果,将60只健康黑山羊随机分为3组,即重组细菌组、弱毒疫苗组和空白对照组,重组细菌组灌服重组减毒沙门菌,弱毒疫苗组股内侧皮内注射山羊痘弱毒疫苗,空白对照组不作任何处理;于不同时间段采集山羊血液、呼吸道/消化道分泌液及组织样本进行检测。结果:(1)在免疫后7、15、30和45d的山羊消化道特异性SIgA含量中,重组细菌组明显高于弱毒疫苗组(P<0.05),45d时到达最高值(18.172±0.122)μg·L-1;(2)在诱导产生特异性P32抗体上,重组细菌组略低于弱毒疫苗组,但差异不明显(P>0.05);(3)在特异性淋巴细胞转化效率上,免疫15d前重组细菌组略低于弱毒疫苗组,但免疫30d后重组细菌组高于弱毒疫苗组,但差异均不显著(P>0.05);(4)在诱导产生特异性细胞因子方面,重组细菌组山羊血清IL-2含量低于弱毒疫苗组,差异极显著(P<0.01),血清IL-5含量高于弱毒疫苗组,差异极显著(P<0.01),血清TNF-β高于弱毒疫苗组,差异显著(P<0.05),而血清IFN-γ和TNF-α含量与弱毒疫苗组差异不显著(P>0.05)。上述结果表明,构建的携带pVAX1-GPV-P32重组减毒沙门菌能诱导山羊产生较好的免疫应答反应。

GLP-1重组减毒沙门菌治疗对2型糖尿病小鼠的Caveolin-1及胰岛β细胞自噬相关因子的影响

目的探讨GLP-1重组减毒沙门菌治疗对2型糖尿病小鼠的Caveolin-1、胰岛β细胞自噬相关因子的影响。方法将纳入的40只小鼠分为正常组、对照组、空载组及治疗组,每组各10只。正常组正常饲养,对照组、空载组及治疗组使用链脲佐菌素(STZ)造模;对照组及正常组采用生理盐水干预,空载组采用空载体重组减毒沙门菌干预,治疗组采用GLP-1重组减毒沙门菌干预;在造模前、造模成功后及治疗结束后进行眼眶取血,使用血糖仪检测血中血糖水平,治疗结束后检测小鼠Caveolin-1、胰岛β细胞自噬相关因子表达情况。结果治疗组小鼠血糖水平治疗后显著低于对照组及空载组(P<0.05);治疗组小鼠胰岛Caveolin-1水平治疗后显著高于对照组及空载组(P<0.05),对照组及空载组Caveolin-1水平与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后治疗组小鼠胰岛Atg3、Atg12及Beclin1水平显著低于对照组及空载组(P<0.05),对照组及空载组Atg3、Atg12及Beclin1水平较治疗前无明显差异(P>0.05)。结论采用GLP-1重组减毒沙门菌治疗后可有效改善2型糖尿病小鼠Caveolin-1及胰岛β细胞自噬相关因子表达,有较广的应用价值。

重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位和过氧化氢酶疫苗治疗幽门螺杆菌感染的实验研究

目的 利用人类幽门螺杆菌 (Hp)感染的小鼠模型研究重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位和过氧化氢酶疫苗在治疗Hp感染中的作用。 方法 将 30只二级C5 7BL/ 6小鼠随机分成 3组 ,通过灌胃方法每只小鼠均用活力良好的Hp菌株隔日攻击 2次。在第二次Hp攻击后 4周 ,分别给予重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位疫苗 (A组 )、过氧化氢酶疫苗 (B组 )和生理盐水 (C组 )灌胃 1次 ,4周后处死动物 ,取胃组织分别行尿素酶试验、改良Giemsa染色及定量细菌培养 ,观察Hp定植情况。行HE染色观察胃黏膜组织炎症情况。取脾组织行淋巴细胞增殖试验。结果 C组小鼠Hp定植密度为 1.92× 10 6CFU/g胃组织 ,A组和B组小鼠分别为 1.5 8× 10 5CFU/g和 4 .88× 10 5CFU/g胃组织 ,两个治疗组的定植密度明显降低 (P <0 .0 5 )。治疗组与对照组胃黏膜均无明显炎症反应。治疗组脾淋巴细胞增殖试验阳性。结论 重组减毒沙门菌尿素酶B亚单位疫苗和过氧化氢酶疫苗对Hp感染有治疗作用。

重组减毒沙门菌粘膜免疫的研究进展

文章介绍以减毒沙门菌为载体进行粘膜免疫的机制 ,讨论沙门菌的不同减毒类型 ,所用的启动子 ,可呈递的抗原 。

人乳头瘤病毒HPV6b重组减毒沙门菌粘膜免疫的效果测定

为观察人乳头瘤病毒 6b型 (HPV6b )的重组减毒沙门菌载体疫苗粘膜免疫小鼠的免疫效果及探讨研制治疗尖锐湿疣的治疗性粘膜疫苗的机制 ,我们用构建的HPV6b重组减毒沙门菌粘膜免疫BALB/c小鼠 ,检测了阴道冲洗液中特异的SIgA、血清中IgG、T淋巴细胞增殖以及载体疫苗在机体内的稳定性。结果表明 ,粘膜免疫后 ,实验组与对照组相比较 ,阴道冲洗液中抗HPV6bL1的SIgA差异显著 ,实验组血清中抗HPV6bL1IgG水平低 ,T淋巴细胞增殖明显 ,疫苗在小鼠体内持续存在4 0d以上。研究结果提示我们所构建的重组减毒沙门菌粘膜免疫小鼠后 ,阴道粘膜局部能分泌特异的抗人乳头瘤病毒HPV6bSIgA ,也能激发细胞免疫 ,且此疫苗在小鼠体内能稳定存在。

减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗载体研究进展

活载体疫苗技术的发展促使产生了更多的疫苗设计新思路。沙门菌是一种肠道细菌,目前已通过基因突变的方法构建了许多种减毒株,如GID101、GID105、X4064、ZJⅢ、Ty800、X4632、X4550、X4072和X3730等,这些减毒株被突变掉了两个或两个以上的基因,然而其基因型和血清型仍很稳定,所以人们常将其用作基因疫苗的表达载体或运送载体。现在已有许多种细菌、病毒和寄生虫的减毒沙门菌活载体疫苗被研制成功。文章对沙门菌的减毒方法,减毒沙门菌的免疫机理以及其用途和作为疫苗载体的优缺点做了简述。

改良的重组减毒沙门菌疫苗的毒性降低

最近，美国亚利桑那州立大学的研究人员研发了一项新技术，这项技术可增加重组减毒沙门菌疫苗的安全性。

减毒沙门菌体内介导基因转移对ACC-M抑制的实验研究

目的:观察构建含有Tip30与人IFN-γ基因的真核表达及共表达质粒的重组减毒伤寒沙门菌对腺样囊性癌肺转移抑制作用。方法:4周龄BALB/Cnunu雄鼠25只,随机分成5组,每组5只,其中对照组5只(PBS)、单纯减毒沙门菌组5只(SL7207)、携带人IFN-γ基因减毒沙门菌治疗组5只(SL7207/pCI-IFN)、携带Tip30基因减毒沙门菌治疗组5只(SL7207/pCI-Tip30)、携带Tip30与人IFN-γ基因的真核共表达质粒的重组减毒沙门菌治疗组5只(SL7207/pCI-Tip30/IFN),均于尾静脉接种高转移腺样囊性癌(ACC-M)细胞。10d后对照组裸鼠口服PBS,其余各治疗组口服相应的减毒沙门菌,隔周1次,共3次。检测:裸鼠肺转移肿瘤细胞内IFN-γ、Tip30的表达、肿瘤生长体积、瘤体重量、带瘤存活期。结果:在治疗组裸鼠肺转移肿瘤细胞胞浆内有对应表达IFN-γ、Tip30;各治疗组均较对照组肿瘤生长慢,肿瘤体积小,重量轻,抑瘤率高,带瘤存活期长;携带基因治疗组较SL7207治疗组肿瘤生长慢,肿瘤体积小,重量轻,抑瘤率高,带瘤存活期长;联合基因治疗组较单基因治疗组肿瘤生长慢,肿瘤体积小,重量轻,抑瘤率高,带瘤存活期长。结论:减毒伤寒沙门菌不仅能作为载体介导基因对腺样囊性癌肺转移有抑制作用,而且自身对腺样囊性癌肺转移也有抑制作用。联合基因较单基因抑制效果好,有协同作用。

表达禽流感病毒HA2-DEC205的减毒沙门菌DNA疫苗载体的构建与初步研究

构建表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型重组减毒沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-sec)和χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec),将其免疫小鼠,通过流式细胞术检测免疫细胞的变化。结果表明,沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec)能够提高CD3+CD4+T细胞分泌细胞因子IL-4、IFN-γ的水平。这说明重组沙门菌免疫小鼠能够激活机体的免疫系统,诱导发生一定的免疫反应。