抗噻虫嗪重组全长抗体的制备与特异性识别机制研究

本研究旨在制备抗噻虫嗪的重组抗体,并采用计算机辅助的同源建模和分子对接的方法解析抗体和噻虫嗪的特异性分子识别机制。首先,采用表面等离子共振技术评价了抗噻虫嗪单克隆抗体的识别性能;其次,以抗噻虫嗪杂交瘤细胞株为基因来源,经分子克隆获得了抗体可变区序列,由哺乳动物细胞HEK 293(F)体外表达成功获得了全长重组抗体;最后,基于正确的可变区序列,采用同源建模和分子对接手段,研究了抗体高亲和力特异结合噻虫嗪的分子识别机制。结果表明,抗噻虫嗪单克隆抗体可特异性识别噻虫嗪,且与其具有较高的结合亲和力(解离平衡常数KD=7.995×10^(-11) mol/L)。由HEK 293(F)体外表达的全长重组抗体,采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法进行评价,表明该重组全长抗体对噻虫嗪的IC_(50)值为0.41μg/L,与其他新烟碱类农药的交叉反应率<0.04%,表现出与亲本单克隆抗体一致的性能,即具有高特异性、高灵敏度的识别活性。分子对接计算结果表明,位于疏水结合口袋参与形成范德华力的8个氨基酸残基和参与形成氢键的Asn39(L-CDR1)残基与抗体的选择性(特异性)相关,位于重链CDR区的两个氨基酸His35(H-CDR1)和Trp108(H-CDR3)残基决定了抗体对噻虫嗪的结合亲和力。该研究制备的重组全长抗体可代替传统单克隆抗体建立多种免疫检测方法,应用于环境样品和农产品中噻虫嗪的残留检测。解析的噻虫嗪抗原抗体分子识别机制,可为后续改造更高亲和力的抗体提供理论依据。

细菌内同源重组构建和制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒

利用细菌内同源重组法构建制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒。先自过氧化氢酶质粒载体pZeoSV2-Cat中酶切出过氧化氢酶cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-Cat,再转化含pAdEasy-1的超感受态大肠杆菌BJ5183,采用细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat;用PacI酶切线性化pAdEasy-1-Cat,转染Ad-293细胞,包装成重组腺病毒颗粒;用氯化铯超速梯度离心纯化获取高滴度的重组腺病毒AdCat。结果发现,线性化的pShuttle-CMV-Cat转化含pAdEasy-1的超感受态大肠杆茵BJ5183,24 h后获得了30％阳性重组质粒克隆,经酶切鉴定说明pAdEasy-1-Cat构建成功。重组质粒经Ad-293细胞包装后产生的重组腺病毒经聚合酶链反应检测表明含有目的基因。氯化铯纯化获取的重组腺病毒滴度为4.12×1015OPU/L。说明应用细茵内同源重组能快速构建含过氧化氢酶基因的重组腺病毒载体pAdEas-1-Cat,可高效制备均一的高滴度重组腺病毒。

Microstructure of partially remelted billet of AM60 alloy prepared with self-inoculation method

The billets of AM60 alloy, prepared with self-inoculation method, were partially remelted into semisolid state. Effects of process parameters on remelting microstructure of semisolid billet were investigated. Experimental results show that the solid particles obtained with self-inoculation method are in smaller grain size and globular shape after partial remelting, compared with those prepared with other casting methods. In the optimized process conditions, the average size of solid particles of partially remelted billet is 65 μm, and the shape factor is 1.12. The process parameters, i.e. pouting temperature, addition amount of self-inoculants, and the slope angle of multi-stream mixing cooling chalmel have influence on the microstructure of partially remelted billet. The optimized temperature is from 680 ℃ to 700 ℃, addition amount of self-inoculants is between 5% and 7% （mass fraction）, slope angle of multi-stream mixing cooling channel is between 30° and 45°, with which the dendritic microstructure of as-cast billet can be avoided, and the size of solid particles ofremelted billet is reduced.

分子串联重复策略用于制备超短肽

超短肽具有更好的稳定性、组织渗透性、生物相容性以及更低的免疫原性。GHK(glycyl-L-histidyl-L-lysine)和GQPR(glycyl-L-glutamyl-L-prolyl-L-arginine)具有刺激胶原蛋白产生、减缓胶原蛋白降解的作用,作为抗皱成分广泛应用于化妆品。超短肽一般都是通过固相合成方法制备,其缺陷是制备过程中大量使用有机化学试剂而造成环境负担,故本文探讨了一种设计和制备超短肽的新方法。因序列短而无法直接重组表达,文中首先构建了适用于融合表达的载体骨架pET28a-Trxm。以GHK和GQPR串联重复基因作为滚环扩增的基本单元(tandem repeat of short peptides,TRSP),反应时随机掺入5-甲基胞嘧啶获得长基因片段,然后经Acc65Ⅰ和ApaⅠ消化产生随机长度的基因。胶回收500 bp到1500 bp的DNA片段,克隆得到表达载体pET28a-Trxm-(TRSP)n并转化获得重组菌。双酶切及测序结果表明,成功构建获得串联重复数n=1、2、3、4、6、7、8、9的阳性克隆。蛋白表达结果显示,当串联重复数n=1、2、3、4、8、9时均有相应融合蛋白表达,表达水平随着重复数增加而降低。Trxm-(TRSP)1表达水平最高,达总蛋白的50%,而Trxm-(TRSP)2表达水平为总蛋白的30%。进一步地,含Trxm-(TRSP)1的清液先后经肠激酶和胰蛋白酶切割后,HPLC分析结果表明,成功获得超短肽GHK和GQPR。该结果对于超短肽重组制备的工业化应用具有重要价值。

极端嗜热微生物分子伴侣蛋白研究与嗜热功能蛋白质的规模化制备技术研究

极端微生物是丰富的资源宝库,有着巨大的生物技术开发前景。本文从特殊功能蛋白质的发现与表征、结构与功能及潜在性应用,以及特殊功能蛋白质的规模化制备技术两个方面,对极端微生物的资源开发与利用进行了探讨。重点介绍了极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus分子伴侣蛋白系统的一些研究,并以P.furiosus胞外α-淀粉酶PFA为例,对工业生物技术领域重组蛋白质的规模化制备技术进行了讨论。

pH法防止转基因蓝藻向环境释放

[目的]防止转基因蓝藻(Anabaena sp.PPC 7120)在制备对虾抗白斑综合征病毒口服药过程中向环境释放,保证制药安全性。[方法]用不同pH处理转基因蓝藻,并在不同时间、温度和光照下观察效果,并用响应面法优化处理条件。[结果]最佳处理条件为:pH≤2.5、t≥50 min、T≥30℃或pH≥12、t≥120 min、T≥30℃,杀藻率为100%。两个优化组合分别为:pH 2.12、温度29.96℃、时间33.9 min或pH 12.33、温度31.75℃、时间96.8 min。pH处理后的转基因蓝藻在平板上不能再继续生长。[结论]pH法对转基因蓝藻的杀藻率可达100%,有效防止了转基因蓝藻在制备对虾口服剂过程中发生环境释放。