重组双功能水蛭素的发酵、纯化和鉴定

构建了重组双功能水蛭素 (Recombinant RGD Hirudin、r RGD Hirudin )cDNA的表达质粒RGD Hirudin pPIC9K ,转化入毕赤酵母中 ,经筛选得到高表达的阳性克隆。种子菌经过 3d发酵培养 ,其培养液上清经超滤浓缩、凝胶过滤层析和离子交换层析后 ,得到纯度大于 97%、比活性为 12 0 0 0ATU mg的r RGD Hirudin ,回收率大于 6 0 % ,发酵产率为 1g L。纯化后的r RGD Hirudin经过还原SDS PAGE ,抗凝血酶活力分析、抗血小板聚集分析、质谱分析及等电聚焦分析等方法鉴定 ,证明该表达产物为水蛭素的衍生物 ,具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重功能。

重组双功能水蛭素PLGA微球的制备及其特性(英文)

目的①建立RGD-Hirudin微球制备工艺;②建立缓释微球制剂中药物活性、含量的测定方法;③分析微球制备工艺中的各个关键参数对微球质量的各个指标的影响情况.方法选择聚乙烯醇（PVA）作为助乳剂,聚乳酸聚羟基乙酸（PLGA）作为微球的生物可降解载体,二氯甲烷作为有机溶剂,溶剂蒸发温度为室温,运用溶剂挥发法制备W/O/W的双乳微球制剂.在微球的制备工艺研究中,考察内水相中水油比例对微球粒径以及收率的影响,助乳剂PVA浓度对微球外观以及微球的包封率和收率的影响,超声次数对微球成球率以及药物活性的影响,挥发搅拌速度对微球的成球率以及外观的影响,不同黏度的PLGA对微球的外观以及分散度的影响,NaCl浓度对微球的包封率、收率以及载药量的影响等.结果利用颗粒粒径系统（PSS）对所制备微球样品的分析得出,微球平均粒径81.38μm,适合作进一步体内研究.几批微球的载药量和收率都很高,分别为83.92%～96.3%和79.93%～95.05%;包封率为23.95%～65.13%.其中NaCl浓度、PVA浓度对微球包封率的影响比较明显.结论微球的稳定性实验表明,微球释放率稳定,并且释放的重组双功能水蛭素（RGD-Hirudin）活性稳定性保持良好,体外释放实验得出其具有缓慢释放的效果,为进一步做动物体内实验打下了基础.

重组双功能水蛭素质量标准研究

以生色底物法测定抗凝血酶活性,比浊法测定抗血小板聚集活性,还原型SDS-PAGE测定分子量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后进行肽图分析,其余检测项目按《中国药典》2005版三部规定进行。结果显示,用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》2005版三部的要求。建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于重组双功能水蛭素产品的常规检定。

重组双功能水蛭素抗凝防栓作用的实验研究

目的研究注射用重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin)抗凝防栓的作用。方法选用36只SD大鼠制备股动脉切断吻合模型,随机分成6组,每组6只。1．生理盐水(对照)组。2．肝素钠组(150U/ kg^(-1)·d^(-1))。3．野生型水蛭素组(0．5mg/kg^(-1)·d^(-1))。4．重组双功能水蛭素组(0．1mg/kg^(-1)·d^(-1))。5．重组双功能水蛭素组(0．2mg/kg^(-1)·d^(-1))。6．重组双功能水蛭素组(O．5ms/kg^(-1)·d^(-1))。术前30 min、术后60 min和术后72 h心脏取血,测定血小板聚集率、aPTT、PT、TT和血浆纤维蛋白原的含量。术后3 d,切取吻合口远、近端血管5mm,作病理切片分析。结果重组双功能水蛭素组(0．1mg/kg^(-1)·d^(-1))的血管通畅率与野生型水蛭素组的疗效相同,优于肝素钠组,随着剂量的加大,治疗效果越好,并有明显的量效关系。血液学指标证明：重组双功能水蛭素能抑制血小板聚集,显著延长aPTT、PT和TT,对血浆纤维蛋白原几乎没有影响。结论重组双功能水蛭素具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重活性,抗凝、防栓作用强。与野生型水蛭素相比,产生相同治疗效果所需剂量小,疗效优于肝素钠和野生型水蛭素。

重组双功能水蛭素的抗凝防栓作用

目的探讨新药重组双功能水蛭素(RGDHirudin)的抗凝防栓作用。方法新西兰大白兔30只,行颈动脉吻合术后注射生理盐水、GPⅡb/Ⅲa(血小板表面糖蛋白)单抗、野生型水蛭素和RGDHirudin,比较各组动脉造影、术后病理以及血液学指标的差异。结果RGDHirudin(0.2mg/kg)给药1h后活化部分凝血活酶时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)分别延长至(32.92±2.05)s、(22.98±1.56)s、(45.44±9.40)s,血小板最大聚集率降至(0.29±9.68)%;其通畅率与野生水蛭素(0.5mg/kg体重)一致(60%～100%),并优于抗GPⅡb/Ⅲa单抗(0.2mg/kg体重,40%)。结论RGDHirudin具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重活性,且治疗剂量较小。

新型重组双功能水蛭素构象的核磁共振研究

在核磁共振仪上进行新型重组双功能水蛭素 (bi functional hirudin ,BFH)构象的核磁共振研究 ,通过它在不同介质中 ,脉冲梯度场抑制水峰的质子二维TOCSY核磁共振 (NMR)实验 。

水蛭素对大鼠急性心肌梗死后室性心律失常的影响

【目的】探讨凝血酶的直接抑制剂重组双功能水蛭素对大鼠急性心肌梗死后室性心律失常的影响及相关机制。【方法】将70只雄性SD大鼠随机分为10组:水蛭素(HIR)结扎前(HIR0min)组,HIR结扎后5min(HIR5min)组,HIR结扎后10min(HIR10min)组,HIR结扎后20min(HIR20min)组,HIR结扎后30min(HIR30min)组),和生理盐水(NS)对应的各时间组,即NS0min,NS5min,NS10min,NS20min,NS30min,最终每组7只。观察各组室性心律失常的发生情况,Evans法计量各组心梗面积及采用逆转录聚合酶链反应对各组缺血心肌组织的IP3R家族的三种亚型进行测定。【结果】水蛭素组发生室性心律失常的持续时间及心律失常评分较生理盐水组在结扎后5～20min均减少(P<0.05);IP3R家族的三种亚型均与心梗后室性心律失常持续时间呈正相关性;但IP3R2mRNA在结扎后10min及IP3R3mRNA在结扎后10min和20min,HIR组较NS组下调(P<0.05)。【结论】水蛭素有抗心梗后室性心律失常的发生作用,其机制可能为通过IP3R2和IP3R3实现的,而并非IP3R1。