重组反义c-myc腺病毒对HL-60细胞PCNA表达及其生长影响的研究

目的:研究重组反义c-myc腺病毒(Ad-AS-c-myc)对人急性早幼粒HL-60细胞系的c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)表达及细胞生长抑制。方法:采用重组腺病毒Lac-Z(Ad-LacZ)及Ad-AS-c-myc联合多聚阳离子转染HL-60细胞,X-gal染色判断转染效率。采用MTT、RT-PCR及免疫细胞化学等方法进行研究。结果:多聚阳离子可提高腺病毒对HL-60细胞的转染,Ad-LacZ加入鱼精蛋白硫酸盐转染率达79.8%。Ad-AS-c-myc能抑制HL-60细胞c-myc基因在转录及蛋白水平的表达。Ad-AS-c-myc抑制HL-60细胞生长及活力(抑制率51%),细胞生长停滞后PCNA蛋白表达降低。结论:Ad-AS-c-myc对HL-60细胞具有使生长减缓、增殖能力降低作用,其生物学作用与HL-60细胞c-myc和PCNA的表达受抑有关。Ad-AS-c-myc在急性早幼粒白血病基因治疗中具有潜在的临床价值,其生物学活性与HL-60细胞c-myc和PCNA表达受抑有关。

重组腺病毒介导的反义c-myc基因对HL-60细胞增殖及细胞周期的影响

目的:观察重组反义cmyc腺病毒(AdAscmyc)对急性早幼粒白血病HL60细胞周期及增殖的影响,探讨其作用的分子机制.方法:将AdAscmyc与鱼精蛋白硫酸盐(Protaminesulfate)混合后转染HL60细胞,MTT法观察细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞增殖周期,RTPCR检测cmyc转录变化,免疫细胞化学检测cmyc及增殖细胞核抗原(PCNA)表达变化.结果:AdAscmyc转染HL60细胞后,细胞生长受抑,细胞周期呈现G1期延长、S期缩短,增殖指数逐渐下降,出现大量凋亡细胞.cmyc基因转录及表达下降,PCNA表达降低.结论:AdAscmyc可使HL60细胞的生长减缓,增殖能力降低,凋亡细胞增加.其生物学活性与HL60细胞cmyc和PCNA表达受抑有关.

重组Lac-Z、反义c-myc腺病毒载体的增殖及鉴定

目的:建立重组反义c-myc腺病毒载体(Ad-AS-c-myc)、LacZ腺病毒(AD-Lac-Z)的增殖的方法。方法:对培养的293细胞转染重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体,使重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体在293细胞内大量复制,及时收集病变细胞,反复冻融以释放293细胞中的病毒载体,过滤除细胞碎片,利用倍比稀释法测定病毒载体滴度。PCR技术对扩增重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体进行鉴定。结果:利用293细胞扩增重组腺病毒载体,获得的Ad-AS-c-myc滴度为:2.3×109pfu/ml;Ad-LacZ滴度为:1.2×1010pfu/ml。在Ad-LacZ可见在800bp出现一特异性PCR扩增条带,为腺病毒特异扩增带。Ad-AS-c-myc在800及608bp处出现两条特异扩增条带,分别为腺病毒及反义c-myc特异扩增条带。结论:对转染的293细胞冻融后收集重组腺病毒载体具有高效、可靠、简便、相对经济实用的优点,有推广价值。

重组腺病毒介导反义c-myc基因对人肝癌细胞系的治疗作用

目的：探讨重组腺病毒介导反义 c-myc基因(Ad-ASmyc)治疗人肝癌细胞的作用。方法：观察 Ad-ASmyc对人肝癌细胞系的转导效率，通过细胞生长曲线、克隆形成实验、 DNA片段化分析、RT-PCR、裸鼠皮下移植瘤治疗实验，分析 Ad-ASmyc对人肝癌细胞系 Bel-7402、 QSG-7701、 SMMC-7721和 HCC-9204细胞生长和 c-myc基因表达及裸鼠肿瘤生长的抑制作用。结果： Ad-ASmyc可高效转导人肝癌细胞系，抑制细胞生长；转染细胞克隆形成能力降低，克隆成活率为对照组的53.9％～69.1％，c-myc基因表达下降；Ad-ASmyc处理肝癌细胞， DNA凝胶电泳出现明显的梯形条带，瘤内注射 Ad-ASmyc可抑制裸鼠皮下移植瘤生长。 结论：重组腺病毒介导的反义 c-myc基因转移，有可能成为肝癌基因治疗的一种有效方法。

重组腺病毒介导反义c-myc诱导HL-60细胞粒系分化的作用

目的:研究重组反义c-myc腺病毒(Ad-AS-c-myc)诱导人急性早幼粒HL-60细胞系粒系分化及作用分子机制。方法:采用重组腺病毒Lac-Z(Ad-LacZ)及Ad-AS-c-myc联合硫酸鱼精蛋白转染HL-60细胞,X-gal染色判断转染效率。采用形态学、RT-PCR、流式细胞仪、四唑氮蓝(NBT)还原试验、非特异酯酶染色等方法进行研究。结果:Ad-AS-c-myc能抑制HL-60细胞c-myc基因在转录水平的表达。被转染HL-60细胞在形态上趋向成熟粒细胞,Ad-AS-c-myc使HL-60细胞周期G0/G1阻滞,过氧化物酶、非特异性酯酶活性增强。结论:Ad-AS-c-myc对HL-60细胞具有诱导粒系分化作用。其生物学作用与HL-60细胞c-myc的表达受抑、HL-60细胞出现一些成熟粒细胞的生理功能有关。

反义c-myc重组腺病毒载体的构建及其对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :观察反义c myc重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用 .方法 :构建大鼠反义及正义c myc细菌质粒 ,并将所得细菌质粒及腺病毒E1缺失质粒导入 2 93细胞系 ,经共转染得到正义及反义重组腺病毒载体 .MTT法检测重组腺病毒载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用 ,免疫组织化学染色检测重组腺病毒载体对c Myc蛋白的表达 .结果 :反义c myc重组腺病毒载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖 ,降低气道平滑肌细胞c Myc蛋白的表达 .结论 :反义c

包载反义RNA重组腺病毒微球的制备及逆转肝癌的体内外效果

目的:构建携带反义多药耐药相关蛋白(MRP)基因的重组腺病毒微球,了解包载反义RNA重组腺病毒微球逆转肝细胞癌MRP的治疗效果. 方法:采用可降解的生物材料聚乳酸-聚乙烯醇(PELA) 包被携带反义MRP基因的重组腺病毒制成微球,体外测定微球的粒径、载病毒量、包封率及释放规律,并用其转染人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM,48 h及120 h后检测转染细胞荧光强度.MTT法检测耐药细胞的阿霉素半数致死量(IC50);流式细胞仪检测细胞内红色荧光强度;以β-actin为内参照,以RT-PCR法观察转染后MRPmRNA表达量的高低.观察经肝动脉注射rAdV微球后肿瘤体积大小、生长率及平均生存时间. 结果:成功构建了携带反义MRP基因的重组腺病毒微球,直径约1.765 μm,包封率为52.4%,载病毒率为5.5×1011efu/g,在120 h内释放病毒量接近50%, 总的释放时间长于240 h.释放出的病毒保持活性, 10 mg微球48 h对HepG2/ADM耐药细胞株转导效率可达90%以上.HepG2/ADM细胞48 h及120 h阿霉素IC50为9.72,4.15 ug;以HepG2细胞内DNR的荧光强度为对照,rAdv微球组转染后120 h与HepG2/ ADM及rAdv组比较,细胞内DNR浓度有所升高(168.6±6.97 vs 98.39±6.17;168.6±6.97 vs 112.52±9.21,t=13.68及9.69,P=0.001及0.001<0.01).诱导后HepG 2/ADM MKP高表达,转染Adv微球后48 h及120 h,MRPmRNA的表达强度较转染前明显降低,以120 h表达最弱.转染Adv微球后120 h与48 h相比,MRPmRNA/β-actin的比值分别较转染前降低16.7% 及63.6%;120 h较转染AdV48 h表达降低26.25%. 治疗组vs对照组,生理盐水组,空白微球组及rAdv 组(n=4),肿瘤生长率显著降低(0.96±0.25 vs 8.79±0.34;4.82±0.30;4.67±0.67;2.97±0.29,t=36.10, 24.43.12.28及13.81,P=0.0001,0.0009, 0.001及0.001<0.05).平均生存时间显著延长(43.6±7.4 vs 23.4±3.2;25.3±3.7;26.5±4.1;33.7±2.9, t=5.521,4.599,4.522,2.796,P=0.005,0.007, 0.007及0.049<0.05). 结论:聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PELA)包载反义RNA 重组腺病毒制备的微球,可有效抑制MRP的表达提高耐药细胞对化疗药物的敏感性,这为高分子化学与基因治疗的结合提供了临床应用的理论基础.

沉默c-myc重组腺病毒载体的构建

目的设计、构建并筛选出转染至人骨肉瘤细胞系OS-9901,对c-myc沉默效果最佳的复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd-c-myc-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)包装出表达c-myc-shRNA的重组腺病毒,并测定其滴度。方法设计有shRNA结构的3对单链寡核苷酸(ssoligos),经变性退火为双链寡核苷酸(dsoligos),插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后,经LipofectamineTM2000阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,采用RT-PCR筛选对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子。采用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒,观察其细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),采用病毒颗粒法(viral particles,VP)和50%组织培养感染剂量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)测定病毒滴度。结果电泳验证后的dsoligos插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确。从3对dsoligos通过RT-PCR方法筛选出对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经PacⅠ酶切线性化后同源重组成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒,CPE和空泡现象3d开始出现,6d更加明显。采用VP法测定的第1代腺病毒滴度为5.23×109VP/mL,经3～4代扩增后可达2.26×1012VP/mL。TCID50证实病毒滴度为10-3.8/0.1mL。结论通过RNA干扰技术,体外成功构建了介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒。

携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建

目的 构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究。方法 将 MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183胞内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义 MRP的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- ASmrp。结果 成功地构建了携带反义 MRP的重组腺病毒载体系统 ,经测定病毒滴度可达 2 .5× 10 9。结论 构建的重组腺病毒 Ad Easy- GFP-ASm rp可望有效地将反义 MRP导入人肝癌耐药细胞株 。

应用AdEasy系统构建携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒的实验研究

目的:应用腺病毒载体AdEasy系统构建携带反义多药耐药相关蛋白(multidrugresistance-associatedprotein,MRP)的重组腺病毒载体。方法:将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183体内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASmrp。结果:成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒载体系统,经测定病毒滴度可达2.5×109efu/ml,感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为100时对SMMC-7721/ADM细胞株转导效率可达90%以上。结论:腺病毒载体AdEasy系统能简便、有效地产生重组腺病毒,且生成的病毒滴度高、转导效率好,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础。

包载反义RNA重组腺病毒微球体外逆转肝细胞癌MRP的表达

目的了解包载反义RNA重组腺病毒微球对肝细胞癌多药耐药相关蛋白(MRP)的作用。方法采用可降解的生物材料聚乳酸-聚乙烯醇(PELA)包被携带反义MRP基因的重组腺病毒制备的微球转染人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM,48h及120h后以MTT法检测耐药细胞的阿霉素半数抑制浓度(IC50);流式细胞仪检测细胞内红色荧光强度,以荧光指数代表柔红霉素(DNR)浓度;以β-actin为内参照,用RT-PCR法观察转染48h及120h后耐药细胞MRPmRNA表达量的高低。结果HepG2/ADM耐药细胞48h及120h阿霉素IC50为9.72mg/L和4.15mg/L;HepG2/ADM细胞内DNR红色荧光强度明显升高,转染Adv微球后48h及120hMRPmR-NA/β-actin的比值分别较转染前降低16.7%及63.6%。结论包载反义RNA重组腺病毒微球可有效抑制MRPmRNA的表达,增加HepG2/ADM耐药细胞内化疗药物的浓度,提高耐药细胞对化疗药物的敏感性,为进一步研究体内逆转肝癌耐药提供实验基础。

携反义基质金属蛋白酶-2的重组腺病毒对肝癌生长的影响

目的探讨携带反义二型基质金属蛋白酶(MM P 2)基因的重组腺病毒(A d-MM P 2AS)对人肝癌细胞株(B e l-7402)体外侵袭性和人肝癌动物模型生长的抑制作用。方法用已构建的A d-MM P 2AS感染人肝癌细胞株(B e l-7402),用侵袭小室模型检测A d-MM P 2AS对B e l-7402细胞降解人工基底膜的抑制作用;用W estern B lot和明胶酶谱检测A d-MM P 2AS对B e l-7402细胞分泌MM P 2的影响;用感染了A d-MM P 2AS的B e l-7402细胞接种于裸鼠皮下,使其在裸鼠体内成瘤,以观察其成瘤能力;用A d-MM P 2AS瘤内注射,以观察它对肝癌生长的抑制作用。结果A d-MM P 2AS感染的B e l-7402细胞分泌MM P 2被抑制、穿过人工基底膜M atrige l的B e l-7402细胞数下降52%、感染A d-MM P 2AS的B e l-7402细胞的成瘤量下降4.3倍,A d-MM P 2AS瘤内注射后瘤体生长减少63%。结论A d-MM P 2AS能明显抑制肝癌的生长,对肝癌有治疗潜力。

携带反义多药耐药基因的重组腺病毒载体的构建

从携带有全长人类 MDR1c DNA的质粒 p Ha MDR1- 1获得 MDR1基因片段 ,将其反向克隆到腺病毒载体 Ad Easy系统的穿梭质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装生成携带反义 MDR1基因片段的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- as MDR1,可以有效地感染人肝癌耐药细胞株 。

携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒的构建及其应用的初步研究

目的 构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒并转染人肝癌耐药细胞株 ,为肝癌耐药的基因治疗提供实验研究基础。方法 将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack CMV上 ,与骨架质粒在细菌体内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy GFP ASmrp ,再用其转染人肝癌耐药细胞株SMMC 772 1 /ADM。结果 成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒 ,病毒滴度为 2 .5× 1 0 9efu/ml,多重感染复数为 1 0 0时对SMMC 772 1 /ADM细胞株转导效率可达 90 %以上。结论 构建的重组腺病毒AdEasy GFP ASmrp可望有效地将反义MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为肝癌耐药机理及其逆转方式的研究提供实验基础。

携反义二型基质金属蛋白酶基因的重组腺病毒的构建

目的 构建携带反义二型基质金属蛋白酶 (MMP2 )基因的重组腺病毒。方法 从新鲜肝癌组织中提取总RNA ,用RT PCR法合成MMP2cDNA序列中 5′端转录起始位点附近长约 5 0 0bp的基因片段 ,将此片段反义克隆到腺病毒载体 (AdEasy)系统的多克隆位点 ,经转染 2 93细胞生成携带反义MMP2基因的重组腺病毒Ad MMP2 AS。结果 成功构建并包装携带反义MMP2基因片段的重组腺病毒Ad MMP2 AS,病毒滴度达 1× 10 8/ml。结论 构建的重组腺病毒Ad MMP2 AS可望能有效地将反义MMP2基因片段导入人肝癌细胞株 ,为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及探讨抑制肝癌浸润和转移的方法提供实验基础。

包载反义MRP重组腺病毒微球肝动脉注射治疗肝癌的实验研究

目的探讨包载反义MRP重组腺病毒微球逆转肝癌的效果。方法设无处理组、生理盐水组、空白微球组as-MRP rAdV组,采用携带as-MRP rAdV PELA制备的微球经肝动脉注射组等5组,观察其靶向性治疗效果。结果rAdV微球组肿瘤体积及生长率显著小于其他4组(均P<0.05),平均生存时间显著延长(均P<0.05),可见肝癌组织rAdv荧光强表达。结论rAdV微球可显著缩小肝脏肿瘤体积,抑制肿瘤生长。

重组腺病毒介导MRP反义RNA对人肝癌耐药细胞株MDR表型逆转的实验研究

目的探讨重组腺病毒载体介导的多药耐药相关蛋白(M RP)反义RNA对多柔比星(阿霉素)诱导的人肝癌耐药细胞株SMM C-7721/ADM多药耐药表型的逆转作用。方法将M RP基因5′端转录起始位点附近长约500 bp的基因片段反向克隆到腺病毒A dE asy系统的穿梭质粒A dT rack-CM V上,通过在细菌内同源重组、并在293细胞中包装、扩增,构建出携带反义M RP的重组腺病毒A dE asy-GFP-A sm rp(简称A d-A sm rp),测定其滴度及对肝癌细胞SMM C-7721/ADM的转染效率;在体外用M O I为100的该重组腺病毒转染肝癌细胞SMM C-7721/ADM,测定转染后细胞对阿霉素(ADM)及柔红霉素(DNR)的半数致死量(IC50)并计算耐药倍数(RF值);在转染后不同时间点(24、48、72、96、120小时)用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P190表达、并用RT-PCR反映细胞M RP之mRNA水平的变化(以βactin mRNA水平为内对照)。结果重组腺病毒A d-A Sm rp滴度可达2.5×109efu/m l,M O I为100时,即可致90%以上的肝癌细胞SMM C-7721/ADM被感染。体外实验中,该重组腺病毒(M O I=100)转染后的人肝癌耐药细胞SMM C-7721/ADM对ADM、DNR的IC50分别为0.487μg/m l、0.328μg/m l,RF分别为97.4倍、109.3倍,RF分别下降36.8倍和35.4倍。在转染后24小时,M RP之mRNA水平开始下降并呈持续下降趋势(P<0.05),48小时后伴有P190蛋白表达的持续下降(P<0.05),二者趋势一致。转染后48小时,经流式细胞仪测得细胞内DNR浓度出现上升趋势(P<0.05),此后持续明显上升(P<0.05)。结论重组腺病毒介导的M RP反义RNA可有效封闭M RP基因表达,降低P190蛋白水平,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株SMM C-7721/ADM对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的M DR表型有较好的逆转作用,并为肝癌M DR机制及其逆转方式的研究提供实验基础。

反义VEGF165腺病毒重组体的构建及鉴定

目的 :构建含人反义血管内皮生长因子 16 5 (VEGF16 5 )基因的重组腺病毒载体 ,为采用反义VEGF16 5RNA防治肿瘤的研究奠定基础。方法 :将人VEGF16 5cDNA反向插入到穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下 ,即pAd -ahVEGF16 5。后者与pJM17通过脂质体共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得含人反义VEGF16 5基因的重组腺病毒Ad -ahVEGF16 5。通过PCR共扩增法鉴别Ad -ahVEGF16 5的正确与否。根据 2 6 0nm的紫外光吸收值计算病毒滴度。结果 :VEGF16 5cDNA成功地反向插入了pHCMVSP1A载体 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了5 76bp的反义VEGF16 5基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad -ahVEGF16 5的正确性。病毒滴度为5 .6× 10 11pfu/ml。结论 :成功构建了携带人反义VEGF16 5基因的腺病毒Ad -ahVEGF16 5 ,本研究为采用反义VEGFRNA途径治疗肿瘤的在体。