家蚕变应原tropomyosin基因的克隆表达、纯化及其免疫学活性鉴定

目的对家蚕过敏原tropomyosin基因进行克隆表达,鉴定其免疫学活性。方法本研究提取家蚕总RNA,采用RT-PCR方法有效地扩增出tropomyosin片段,其长度为858bp,编码286个氨基酸。通过连入载体PET28a在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)菌株中通过IPTG诱导得到重组家蚕原肌球蛋白。重组家蚕原肌球蛋白经过6His-tag蛋白纯化系统分离、纯化。经Westernblot检测该重组蛋白与家蚕过敏患者血清中IgE的反应性。结果19个病人血清反应中,有5个呈阳性,阳性率为26%。结论成功克隆表达了家蚕tropomyosin基因,经免疫学鉴定发现其具有过敏原性。

屋尘螨重组变应原Der p 2的表达、纯化及免疫学活性鉴定

目的大量诱导表达含pET24a-Derp2质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,经包涵体洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用梯度复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Western blot方法分析Derp2重组蛋白的免疫学特性。纯化后的融合蛋白Derp2具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。

重组变应原rDer f 1对哮喘小鼠CD4^+CD25^+调节性T细胞及肺部病理的作用

目的探讨粉尘螨变应原第1组分重组体rDerf1对哮喘小鼠CD4+CD25+调节性T细胞及肺部病理的作用。方法28只小鼠随机等分为正常对照组(A),模型对照组(B),粗提浸液治疗组(C)和rDerf1治疗组(D);B、C、D组腹腔注射粉尘螨粗提浸液建立哮喘模型后,C、D组分别予粉尘螨粗提浸液和rDerf1,A、B组注射生理盐水。用流式细胞仪检测小鼠外周血单个核细胞膜表面CD3+、CD4+、CD8+及CD4+CD25+。回收小鼠一侧肺泡灌洗液(BALF)显微镜下计数并分类,用酶标仪检测其中IL-4和IFN-γ含量,取另一侧肺组织,镜下观察肺组织病理变化。结果与B组相比,C、D两组CD3+T细胞百分比增高(P<0.05),但仍低于A组(P<0.05),C、D两组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C、D4个组CD4+CD25+Treg依次为(5.31±0.25)、(3.79±0.19)、(4.39±0.24)、(4.29±0.33)%,差异有统计学意义(P<0.01,F=42.117),但C、D两组间差异无统计学意义(P>0.05)。与B组相比,C、D组BALF中细胞总数下降,以C组下降的更为显著,但仍高于A组,A、B、C、D组间差异有统计学意义(P<0.01)。A、B、C、D4组小鼠IL-4水平依次为(15.86±0.55)、(163.95±9.94)、(54.09±3.49)、(113.97±10.00)pg/mL,IFN-水平依次为(762.66±31.21)、(326.01±18.71)、(653.50±41.41)、(462.61±26.08)pg/mL,差异均有统计学意义(P<0.01)。A、B、C、D组肺组织Underwood标准评分依次为(0.16±0.01)、(3.28±0.22)、(1.13±0.07)、(2.36±0.11),差异有统计学意义(P<0.01,F=760.51)。结论重组变应原rDerf1具有免疫调节作用,可以上调Th1反应,下调Th2反应,并能增加CD4+CD25+Treg细胞数量,改善哮喘小鼠肺部炎症。

重组葎草花粉主要变应原免疫特性研究

目的鉴定重组葎草花粉主要变应原pTSX2的免疫特性,并初步评价其安全性。方法应用Western blotting鉴定pTSX2的免疫特性;ELISA法检测经pTSX2免疫的小鼠血清sIgE、sIgG水平;pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后:ELISA法测定小鼠血清sIgE、sIgG水平;计数小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及嗜酸性粒细胞(Eos)比值;ELISA法检测小鼠BALF中及脾组织匀浆中细胞因子(IL-4、IFN-γ)水平;评价小鼠肺组织炎症程度。结果 Western blotting结果显示重组表达的pTSX2可与70%的葎草花粉特异性过敏的变应性哮喘患者血清发生抗原抗体反应;pTSX2免疫正常小鼠后主要诱导产生血清sIgG;pTSX2免疫治疗小鼠哮喘模型后:血清中sIgE、sIgG的抗体水平分别为(146.74±28.57)和(548.76±11.98)μg/ml,与哮喘模型组的(603.06±10.00)和(260.32±6.40)μg/ml相比差异有统计学意义(P<0.05);BALF中细胞总数及Eos百分比与哮喘模型组相比明显下降(P<0.05);BALF中IL-4、IFN-γ水平分别为(56.74±28.57)和(49.7±11.98)pg/ml,与哮喘模型组的(89.03±10.00)和(23.10±6.40)pg/ml相比差异有统计学意义(P<0.05);脾组织匀浆中IL-4、IFN-γ水平分别为(126.24±37.00)和(1547.72±490.43)pg/ml,与哮喘模型组的(457.95±70.06)和(720.34±93.96)pg/ml相比差异有统计学意义(P<0.05);肺组织炎症程度减轻。结论重组葎草花粉主要变应原pTSX2具有较好的免疫治疗作用,且安全性较高,其机制可能是抑制变应原sIgE抗体、诱导变应原sIgG抗体产生,降低气道炎症细胞浸润,调节Thl/Ih2平衡。

家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

对家蝇变应原原肌球蛋白(Tropomyosin)基因进行同源克隆,序列分析;构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板,进行PCR扩增,获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒,转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp,编码275个氨基酸,理论分子量31.6 kD;等电点为4.65,具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。

尘螨主要重组变应原的研究现状

尘螨是最常见最主要的室内过敏原之一,该文从重组变应原的致敏蛋白特点、致敏蛋白表达量、免疫学机制及其在诊断治疗中的应用等4个方面对重组变应原的研究现状进行了综述。

蟑螂重组变应原的研究进展

根据近十年的国内外相关资料,本文对蟑螂重组变应原免疫学特性以及在临床诊断和治疗方法上的应用等方面进行了综述。

重组变应原的基础与临床

重组变应原(Recombinant allergen,RA)成为近年来变态反应研究的热点,本文简要地介绍了RA的重组方法和技术要点。重点探讨了变应原的T细胞和B细胞决定簇的生物学特性的差别。含有T细胞反应决定族的重组变应原可以封闭T细胞,使特异性IgE的产生降低,在变态反应性疾病的治疗中具有划时代的意义。

野艾蒿花粉变应原Art la 3.0101和Art la 3.0102重组表达与血清IgE反应性特征分析

目的:筛查变应原并明确蒿属植物种属鉴定,深入分析野艾蒿变应原的免疫活性。方法:进行问卷调查及血清特异性IgE(sIgE)检测筛查变应原;采集蒿属样本及内转录间隔区(ITS)序列鉴别物种;构建野艾蒿变应原毕赤酵母蛋白表达载体,转化宿主重组表达和纯化,结果经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和western blotting检测分析。结果:376例受试者血清sIgE检测总阳性率为58.78%,其中艾蒿阳性率高达48.67%。ITS序列物种鉴定发现样本与野艾蒿Artemisia lavandulifolia(KX421740)相似性为99.74%;野艾蒿花粉变应原基因Art la 3毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA-Art la 3.0101和pPICZαA-Art la 3.0102的片段大小分别为798 bp和795 bp。Western blotting检测结果显示重组变应原Art la 3.0102与16例艾蒿过敏患者血清的IgE结合,阳性率为26.7%(16/60),该16例受试者临床症状较重且艾蒿sIgE等级高。结论:野艾蒿是内蒙古及甘肃地区主要致敏源之一,其重组变应原Art la 3.0102具有IgE结合活性,可作为致敏源筛查的候选抗原,并推测对变应原Art la 3.0102过敏可能作为野艾蒿诱发变应性疾病的病情严重程度指标。

花粉重组变应原的研究现状

分子克隆技术应用以来,出现了许多具有免疫活性的花粉重组变应原,这不仅改进了花粉过敏性疾病的诊断和特异性免疫治疗方法,也使花粉变应原的分子和生化特征的鉴定取得了很大进展。本文综述了变应原已被克隆和测序的树木(tree)花粉、牧草(grass)花粉和杂草(weed)花粉的研究现状。

多主枝孢霉重组变应原Cla h8的制备及其免疫活性鉴定

目的:通过基因工程手段,获得重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8,有利于进行变应原的标准化,为标准化抗原的临床特异性诊断与治疗奠定基础。方法:从多主枝孢霉菌体中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Cla h8编码基因,将其连入pET-19b载体。转入大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS,经诱导表达后,进行提纯复性,用Western blot和Dot-blot检测其免疫活性。结果:重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白可以与多主枝孢霉过敏患者的血清中IgE和IgG抗体特异性结合,与天然蛋白具有相似的免疫活性。结论:制备并获得了具有生物学活性的可溶性重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白,可用于多主枝孢霉变应原的标准化,克服天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。

德国小蠊重组变应原(rBla g 2)治疗过敏性哮喘小鼠的实验研究

目的探讨重组德国小蠊变应原(rBlag2)治疗过敏性哮喘小鼠的效果及机制。方法18只BALB/c小鼠随机均分为阴性对照组(A组)、哮喘模型组(B组)和重组蛋白rBlag2治疗组(C组)。B、C两组分别腹腔注射经Al(OH)3佐剂乳化的重组蛋白rBlag2,剂量为50mg/(只·次),共3次,每次间隔1周。A组以50ml生理盐水代替变应原。末次致敏后2周,进行免疫治疗,C组腹腔注射rBlag2,100mg/(只·次),每两天1次,连续8次。A、B两组以PBS代替变应原。末次治疗后1周,将小鼠麻醉,B、C两组每鼠每天滴鼻50mgrBlag2,连续7d。A组以PBS代替变应原滴鼻。于最后1次滴鼻后24h检测各项指标:各组小鼠气道高反应性,支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞种类以及血清中rBlag2抗原特异性IgE和IgG2a的变化;HE染色观察小鼠肺组织的改变,免疫组化检测肺嗜酸粒细胞(EOS)B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达。结果与B组相比,C组气道高反应检测中扩大间隙(Penh)值下降(P<0.05);血清中rBlag2特异性IgE降低,IgG2a增加(P<0.01);C组EOS细胞阳性数量明显减少,且Bcl-2蛋白阳性表达较弱。B组BALF的细胞总数和EOS数分别为(24.60±15.08)×105个/ml和(22.20±3.76)×105个/ml,而C组细胞总数[(14.30±4.95)×105个/ml]和EOS数[(5.20±1.56)×105个/ml]显著减少(P<0.01)。B组肺部气管周围炎性细胞聚集,肺组织上皮损伤,组织水肿,而C组肺部变应性炎症明显减轻。与A组相比,C组各项检测指标接近A组。结论rBlag2对小鼠过敏性哮喘有治疗作用,可能是EOS细胞凋亡在其中起重要作用。

针对蜂毒变应原检测的研究进展

对于膜翅目毒素过敏人群,膜翅目昆虫蜇刺是其不可忽视的危险因素。我国现有的诊断工具无法提供准确的信息来明确致敏昆虫,从而影响临床的诊断和治疗。蜜蜂为常见的膜翅目昆虫,分布地域广、数量多,且其毒素成分复杂,因此国内外研究者已针对蜜蜂毒素主要变应原开展了相关重组变应原方案工作,这为变应原检测提供了一定的理论基础。变应原组分诊断技术的发展可实现准确检测蜂毒变应原,这将为蜜蜂蜂毒过敏患者提供一套全新的临床诊断和治疗方案。

融合表达白细胞介素10与卵清蛋白重组腺病毒口服变应原疫苗的构建及鉴定

目的构建免疫调节因子白细胞介素(IL)-10与模式变应原卵清蛋白(OVA)融合表达的重组腺病毒载体口服疫苗。方法直接合成鸡IL-10及OVA的DNA序列后,采用重叠PCR法进行连接。连接序列插入穿梭质粒p HBAd-MCMV的多克隆区,获得重组穿梭质粒p Ad IL-10-OVA。经测序鉴定后,p Ad IL-10-OVA与腺病毒骨架质粒p HBAd-BHG共转染293细胞,包装获得重组腺病毒Ad IL-10-OVA原代病毒,将原代病毒在293细胞中扩增到合适滴度。采用ELISA法检测细胞上清液中融合蛋白的表达水平。结果重组穿梭质粒插入目标序列经测序鉴定正确,重组腺病毒载体疫苗r Ad IL-10-OVA在293细胞中成功表达。结论成功构建了融合表达IL-10与OVA的重组腺病毒载体疫苗Ad IL-10-OVA,为后续动物实验验证其对变态反应性疾病的防治效应奠定了基础。

重组变应原的治疗应用

近年来,在蛋白质变应原鉴定工作中分子生物学的应用使人们在一些主要变应原互补DNA(cDNA)合成以及确定变应原初级结构方面取得重大进展。从而能够(1)合成相应的重组变应原(RA);(2)描述其中一些变应原的B和T细胞表位;(3)证实某一组空气变应原之间的广泛交叉反应性。一些纯化的大量主要变应原的获得使人们有可能根据现代免疫调节概念对新治疗方法的效果进行评价,这些方法是通过化学改变的重组变应原或其适当改变的表位来抑制IgE抗体产生或灭活变应原特异性辅助性T(Th)细胞。本文讨论了这些方法的潜在用途及其可能优于现有免疫疗法之处。

美洲大蠊变应原CrPI的表达、纯化与免疫学特性鉴定

以阳性噬菌体克隆为模板 ,通过PCR扩增出目的基因片段并克隆入T载体 ,经测序证实为美洲大蠊Periplanetaamericana变应原CrPI后 ,将该基因亚克隆入表达载体pGEX 5X 1。美洲大蠊变应原CrPI在大肠杆菌中得到高效表达 ,但主要以包涵体形式存在于沉淀中。目的蛋白溶于 6mol L盐酸胍并经稀释复性后 ,经GlutathioneSepharoseTM 4B亲和层析 ,纯度达 90 %以上。以蟑螂过敏病人血清进行免疫印迹检测 ,结果显示重组变应原具有良好的IgE结合活性。

美洲大蠊主要变应原Cr-PI基因同源性分析

目的 探索研制美洲大蠊重组变应原疫苗的新途径 ,对美洲大蠊主要变应原Cr PI基因序列进行同源性分析。方法 选用从本室构建的美洲大蠊若虫cDNA文库中筛选到的 5个阳性克隆 ,在测序的基础上 ,通过互联网进入NCBI主页 ,采用Blastn程序 ,将测得的美洲大蠊主要变应原基因序列与GenBank中的基因序列进行同源性分析。结果 所筛选到的美洲大蠊若虫 5个新基因中 ,一个为核糖体蛋白基因 (AF 31 4 962 ) ,一个为美洲大蠊主要变应原Cr PI基因 (AF31 4 963) ,且中国大陆美洲大蠊主要变应原Cr PI基因序列与不同地理分布的美洲大蠊Cr PI基因序列有一定差异。结论 不同地理区域的美洲大蠊同一种变应原其基因序列有一定差异 ,编码的氨基酸亦不相同。本研究提示在临床变态反应疾病的诊断和脱敏治疗中 ,为了提高其诊断的特异性和治疗疗效 ,应尽可能使用具有我国区域特色 (即本地化 )

美洲大蠊若虫变应原的基因克隆及序列测定

目的 对美洲大蠊若虫cDNA表达文库进行免疫学筛选 ,分离和鉴定美洲大蠊若虫特异性重组变应原克隆 ,并测定其基因序列 ,从而为美洲大蠊若虫重组变应原疫苗候选基因的筛选提供科学依据。方法 选用对美洲大蠊若虫过敏的变态反应疾病患者 (如哮喘、过敏性鼻炎 )阳性血清 ,对美洲大蠊若虫cDNA文库进行免疫学筛选。使用按照重组载体入ExCellNotI/EcoRI/CIP臂插入位点邻近区域的上、下游碱基序列设计的引物 ,扩增阳性噬菌斑中插入的cDNA片段。并对cDNA插入片段进行序列测定。结果 经用阳性血清对 2 3× 10 4 噬菌体斑的免疫学筛选 ,获得了 5个阳性克隆 ,PCR直接序列分析表明这 5个阳性克隆均为美洲大蠊若虫变应原未知基因克隆。结论 该研究发现了美洲大蠊若虫变应原新基因 。

粉尘螨变应原第10组分基因克隆表达及生物信息学分析

目的:克隆粉尘螨变应原第10组分(Der f 10)基因并建立其原核表达体系。方法:提取粉尘螨总RNA,反转录后经套式PCR扩增出目的基因并克隆至pMD19-T载体测序,将测序正确的目的基因插入表达质粒pET28a,转化E.coliBL21(DE3)用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果:RT-PCR扩增获得Der f 10,琼脂糖凝胶电泳见一条约888 bp的条带,与参考序列(GenBank No.EU 106617)同源性高达99.8%。将pET28a(+)-Der f 10质粒转化宿主菌E.coli BL21,SDS-PAGE电泳时出现特异性条带,Western blot表明重组蛋白可与抗His-Tag Mab抗体结合。生物信息学软件预测获得的Der f 10重组体由295个氨基酸组成的疏水性蛋白,相对分子质量为34 233.1 Da,二级结构包括α-螺旋(91.86%)、延伸主链(1.36%)和无规卷曲(6.78%),含有5个原肌球蛋白模序分别位于84～101、120～140、145～173、175～198和231～256氨基酸处。结论:获得了Der f 10编码基因,成功建立其原核表达体系,为生产重组变应原用于临床诊断与治疗奠定基础。