共表达PCV2 Cap蛋白和IL-2重组变异株伪狂犬病病毒构建及对小鼠的免疫原性

为获得有效预防猪圆环病毒2型(PCV2)及伪狂犬病(PR)感染的重组活载体疫苗,利用同源重组将PCV2 YY株ORF2和细胞因子佐剂IL-2基因插入rPRV-gE^(-)/TK^(-)/EGFP^(+)缺失的TK基因位点,获得重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)。将重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)及对照rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)、PCV亚单位疫苗、PR活疫苗和DMEM培养液分别免疫小鼠,4周后加强免疫1次,利用PCV2间接ELISA试验、PRV血清中和试验、T淋巴细胞转化试验和细胞亚群及因子测定等评价重组病毒rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)的免疫原性。结果显示,构建的rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)可在BHK-21细胞内表达,免疫鼠产生抗PCV2和PRV的特异性中和抗体,能刺激CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞的增殖及促使IFN-γ、IL-4和IL-12细胞因子的表达水平明显升高。结果表明,成功构建的rPRV-gE^(-)/TK^(-)/ORF2^(+)/IL-2^(+)能有效诱导机体产生较高水平的免疫效果,IL-2起到免疫增强作用,可作为预防猪PR和PCV感染相关疾病的候选疫苗株。

猪伪狂犬病病毒BJC变异株分离鉴定及gB和gE基因序列分析

为了确定伪狂犬病疑似发病猪场PRV变异株病原及其病毒分子特征,通过病理剖检、病毒分离鉴定与纯化、ST细胞TCID_(50)和小鼠LD_(50)测定,对分离鉴定的病毒gB、gE基因进行PCR扩增、回收、克隆和测序,用生物信息学分析软件Geneious Prime对gB、gE基因进行遗传进化和同源性分析。结果显示,该分离株为PRV强毒株。该病毒在ST细胞生长良好,纯化后的病毒经测定半数组织培养感染量为10^(8.5)TCID_(50)/mL,对6周龄昆明小鼠的LD_(50)为10^(5.8)TCID_(50)。测序结果与预期的PRV gB、gE基因片段相符。遗传进化分析可知与国内代表PRV变异毒株如JS2012、HN1201、ZJ01等处于同一分支,与欧美分离株如Bartha、Kaplan、Becker等亲缘关系较远,处于不同的大分支。氨基酸序列分析表明,BJC株与国外经典毒株和国内早期分离毒株存在多个特征性位点替换,符合国内流行变异毒株特征,BJC株为PRV变异毒株。

一株携带EGFP基因的重组伪狂犬病毒变异株的构建

本研究运用同源重组的方法,在伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株PRV JS-2012基础上,构建了一株携带增强型绿色荧光蛋白基因的标记重组伪狂犬病毒,命名为r PRV JS-2012-EGFP。经PCR方法鉴定及荧光显微镜观察分析,结果表明重组病毒构建成功,并能在感染细胞中稳定表达绿色荧光蛋白。生长曲线和空斑试验结果显示,r PRV JS-2012-EGFP与亲本株PRV JS-2012在体外具有相似的生长特性。将r PRV JS-2012-EGFP毒接种14日龄PRV阴性仔猪,能使实验猪100%发病,病死率高达40%,表明r PRV JS-2012-EGFP是一株具有强致病力的标记伪狂犬病毒变异株,在伪狂犬病毒变异株致病机制研究中具有一定的使用价值。

猪伪狂犬病病毒变异株传代致弱JS18-150株的获得与鉴定

为获得安全性良好、免疫原性高的变异株弱毒苗,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养的方法对猪伪狂犬病病毒流行毒株JS18株进行传代,最终获得JS18-150株,随后通过PCR鉴定、测序、致病力试验和免疫效力试验对JS18-150株的体外生长特性、安全性和免疫原性进行初步研究。试验结果显示,在CEF上连续传代后,JS18株的gI、gE、US9基因缺失,获得的JS18-150株毒力已致弱,在CEF上适应性显著提高,与JS18株生长动力学相似;将JS18-150株以107.0TCID50/mL接种仔猪,所有仔猪均未观察到任何临床症状,且体温均未超过40.5℃;JS18-150株以106TCID50/mL接种仔猪后能保护仔猪有效抵御JS18株和HBZL05株的攻击。结果表明,JS18-150株对仔猪安全性良好,可作为PRV弱毒疫苗研制的候选毒株。

表达猪流行性腹泻病毒变异株S基因重组伪狂犬病病毒的构建与鉴定

为研制预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗,本研究应用PRV变异株的细菌人工染色体和同源重组技术,将PEDV流行株的S基因表达盒插入PRV基因组UL40与UL41之间的非编码区,构建重组病毒rPRV-S(UL40-41),该毒株还缺失了TK和gE基因。生长动力学显示该毒株在猪睾丸(ST)细胞的增殖效率与亲本毒株相似,表明S基因表达盒的插入对病毒生长性能无显著影响。重组病毒在ST细胞传至15代,PCR和测序鉴定S基因未发生碱基的丢失和变异,间接免疫荧光显示重组病毒感染鸡胚成纤维细胞后可稳定表达S蛋白。应用该毒株接种断奶仔猪,产生低水平的针对PEDV的抗体。该研究为PRV活载体疫苗的构建奠定了基础。

天津地区猪伪狂犬病毒变异株的分离鉴定及主要相关毒力基因分析

为了鉴定猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株及其携带毒力基因的变异情况,本研究采集1份天津地区某猪场免疫过Bartha-K61疫苗但患严重神经症状的仔猪脑组织样品,采用荧光定量PCR(q PCR)检测PRV g E基因,并将检测为PRV的阳性样品接种PK-15细胞分离培养,并传3代后采用Reed-Muench法测定分离病毒的TCID_(50),采用q PCR和间接免疫荧光试验(IFA)进一步鉴定分离病毒。结果显示,经q PCR检测仔猪脑组织样品出现扩增曲线,阳性样品分离培养后测得病毒滴度为10^(7.57)TCID_(50)/m L,分离病毒的q PCR结果出现扩增曲线,且其感染的细胞出现绿色荧光。表明分离到一株PRV,命名为TJbd2023株。采用PCR分别扩增TJbd2023株主要相关毒力基因g B、g C、g D、g E、g G、g I和TK,采用Meg Align软件分析分离病毒与Gen Bank登录的PRV参考株上述各毒力相关基因序列的同源性,通过Neighbor-Joining(NJ)法构建上述各毒力相关基因的进化树,采用Meg Align软件分析各毒力基因编码氨基酸主要位点的变异情况。结果显示,分别扩增到TJbd2023株的各相应毒力基因;各毒力基因的同源性分析结果显示,TJbd2023株与国内2012年后流行变异株的相似性高达98.4%~100.0%,与疫苗株(Bartha-K61)的相似性为89.6%~93.2%。进化树结果显示,这7个毒力基因均与国内GD0304株(MH582511)、BJYT株(KC981239)和DL1408株(KU360259)等PRV变异株位于同一分支,与疫苗株(Bartha-K61)未在同一分支。g B、g C、g E氨基酸序列除出现PRV变异株相同的突变位点外,g B还出现R^(223)H和E^(836)K的突变、g D出现R^(320)S和g E出现T^(242)A的突变。将TJbd2023株分别以5个剂量(10^(2.57)TCID_(50)/m L~10^(6.57)TCID_(50)/m L)感染6周龄KM小鼠,通过小鼠的临床症状、死亡率、死亡小鼠各组织的病理变化评估该病毒的致病性。结果显示,在5 d的观察期内,感染组小鼠陆续出现奇痒及神经症状,各实验组小鼠的死亡率分别为60%、80%、100%及100%,对照组小鼠均健活。死亡小鼠各组织病变观察可见肺组织浸润性出血、肝组织血管充血及淋巴细胞增多、脑胶质细胞增多及血管周围炎性细胞聚集形成血管套等病变,对照组小鼠各组织均无明显病变。上述结果表明,本研究在天津地区分离到一株PRV变异株,其毒力因子发生了独特的氨基酸位点突变,对小鼠的致病性较强,该结果丰富了PRV的致病性及其毒力因子变异的特征,为PR的综合防控提供参考。

猪伪狂犬病病毒变异毒株与经典毒株实时荧光定量PCR鉴别诊断方法的建立和应用

为了建立猪伪狂犬病病毒(PRV)变异毒株与经典毒株的快速鉴别诊断方法,本试验根据PRV变异毒株与经典毒株的糖蛋白gC基因设计鉴别引物和探针,加入纳米金优化建立实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法,验证其敏感性、特异性和重复性。利用建立的qPCR和测序分析方法同时对新疆4个不同地区采集的猪场临床样品进行检测和分析。优化后的qPCR检测结果显示,重组阳性质粒PUC57-Var标准品在1×10^(9)~1×10^(3)copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999,斜率为-3.325,最低检测限为1×10^(3)copies/μL,与其他猪源常见病毒未发生交叉反应,组内和组间重复性试验的变异系数均小于3%;该qPCR方法对临床样品的检测结果与测序分析结果一致。结果表明,本试验建立的qPCR方法可用于PRV变异毒株与经典毒株的鉴别诊断,为PRV的准确诊断和疫苗应用提供科学依据。

猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重组酶介导核酸扩增检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,应用该方法对临床样品进行检测。【结果】该方法在43℃恒温反应23 min即可完成PRV核酸扩增,最低检出限为111 copies·μL^(-1);与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrheavirus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)均无交叉反应。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;40份临床样品检测结果显示PRV阳性率为15%(6/40),检测结果与常规聚合酶链式反应(PCR)一致。【结论】成功建立了简便快速、高效准确的PRV实时荧光RAA检测方法,为PRV的快速检测和流行病学调查提供了新的检测手段。

猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征

2014年猪伪狂犬病(PR)在我国规模化猪场大范围发生,本实验室在吉林和黑龙江省发病猪场分离到2株PRV,命名为PRV-JL1和PRV-HLJ1。病毒在Vero细胞中能够产生典型的PRV细胞病变,将PRV-JL1以103LD50的剂量感染3只6月龄绵羊,接种羊在5 d^8 d内全部死亡,均出现典型的PR症状及组织病理学变化。将PRV-JL1及PRV-HLJ1与近3年来本实验室分离鉴定的及GenBank中登录的来源于国内10多个省份的32个PRV株和17个经典PRV株的gE核苷酸序列进行比对分析,结果表明:近3年分离的PRVs与本实验室之前分离的变异株PRV-HeN1的同源性在97.1%~99.5%,而与经典株PRV双城株(PRV-S)的同源性在96.6%~99.1%。以gE氨基酸序列建立的进化树分析结果显示,近3年分离的PRVs形成一个相对独立于经典株的新分支。以上结果表明变异株已成为我国主要流行的病毒株,而且变异株均在gE蛋白的第48位和第492位各存在1个天冬氨酸的插入。该插入突变可以作为鉴定PRV变异株的分子特征,其生物学意义有待于进一步研究。

猪伪狂犬病病毒新流行变异毒株的研究进展

近30年内,猪伪狂犬活疫苗的应用对中国猪伪狂犬病的防控贡献巨大。2011年以来,中国许多免疫猪场相继暴发猪伪狂犬疫情,给养猪业造成了巨大的损失。研究显示最新流行的PRV毒株为变异株,部分商品化活疫苗不能对其提供完全的保护。本文详细介绍了2011年以来中国猪伪狂犬病的发病情况及其分子流行病学调查结果,分析了猪伪狂犬新变异株的分子生物学特性及其变异株来源,同时论述了针对PRV突变株新型疫苗的研究进展,最后对深入开展中国猪伪狂犬病控制与净化研究进行了展望。

猪瘟伪狂犬病重组病毒SA215(A)株的构建及生物学特性研究

采用磷酸钙转染系统,将伪狂犬病三基因缺失疫苗SA215株DNA与PP63LacZE2 DNA共转染Vero细胞,获得SA215(A)1、SA215(A)2和SA215(A)3等12个重组病毒株。以光生物素标记的HCV E2基因为探针进行初步鉴定后,挑选SA215(A)1株作BamHI酶切和southern转印杂交鉴定,结果表明构建是成功的,将其命名为SA215(A)。直接荧光抗体检测、SDS-PAGE电泳和western免疫印迹检测结果表明HCV E2基因在重组病毒内获得表达,产生大小约51 ku的囊膜糖蛋白。对SA215(A)株进行部分生物学特性研究,培养特性观察试验表明该毒株可适应Vero、BHK21和鸡胚成纤维细胞等多种细胞,但对不同细胞系表现有一定的差异。SA215(A)株105PFU/mL接种21日龄健康仔猪(伪狂犬病和猪瘟检测阴性),接种后28 d用106PFU的PRV Fa强毒株滴鼻攻毒,42 d用猪瘟SM株血毒1 mL(105MLD/mL)肌肉注射攻击,结果表明接种猪能抵御2次病毒攻击,表明SA215(A)株具有良好免疫原性,是一株优秀的猪瘟、伪狂犬病二价疫苗候选株。

猪伪狂犬病病毒HeN1株全基因组测序及感染和毒力相关基因的变异特征分析

2011年以来我国多个省份免疫过Bartha-K61弱毒疫苗的猪场相继发生猪伪狂犬病（PRl疫情。为分析PR病毒（PRV）流行株的变异情况，本研究对其中一株PRVHeNl分离株进行了全基因组测序，并对PRV感染相关基因（gB、gC、gD和gH）和毒力相关基因（TK、PK、RR1、RR2、gE和gI）进行比较分析。结果显示，国内分离株之间的序列同源性很高（96．2％～100％），而与国外分离株的同源性较低（92．9％～99．7％）；国内分离株与国外分离株在感染和毒力相关基因编码上存在氨基酸突变和插入／缺失特征；并且序列分析表明部分插入／缺失与微卫星序列重复单元数量的变化相关。遗传进化分析表明，国内外分离株间具有显著的遗传差异，处于两个独立的遗传分支。此外，国内分离株相对于国外分离株在gC蛋白中存在7个连续氨基酸的插入（63AAASTPA69），该插入突变可以作为PRV国内外病毒株的分子特征。本研究为有效防制PR提供实验依据。

猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株细菌人工染色体的构建与鉴定

为构建猪源伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA的细菌人工染色体(BAC),本研究将转移载体pHA2-pUC19-H1-H2的DNA与PRV AH02LA株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,利用转移载体中的GFP为筛选标记,获得携带GFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV-AH02LA(gE-/gI-)-pHA2。提取纯化的该重组病毒DNA转化E.coli DH10B,对获得的阳性克隆命名为BAC^(PRV-G)。提取BAC^(PRV-G)的DNA,将含gE、gI和其上下游同源片段的DNA与BAC^(PRV-G)的DNA共转染CEF,获得gE、gZ基因恢复的病毒命名为PRVAH02LA^(Rec)。比较亲本株PRV AH02LA、基因缺失株和恢复株的生长动力学,结果表明,恢复株的生长特性与亲本株无显著差异。本研究成功构建了PRV变异株AH02LA的BAC,并证实其为全基因组的感染性克隆,为PRV变异株的致病机理研究和新型疫苗研制提供了重要的平台。

伪狂犬病病毒变异株的鉴定及伪狂犬病的防控

2011年以来伪狂犬病病毒(PRV)变异株在中国大范围流行致伪狂犬病(PR)再次暴发。广东某猪场发生疑似PR引起母猪较大范围的流产,为此本试验展开对该病诊断和防控方法的研究。随机抽取流产和未流产母猪血清,应用ELISA检测PRV gE和gB抗体;同时采集发病仔猪脑组织PCR检测PRV gH片段。对全场母猪紧急接种PRV变异株灭活苗,分别应用ELISA和中和试验检测免疫前后的血清抗体。结果显示,已发生流产母猪血清PR gE抗体均为阳性,而未流产母猪血清抗体见弱阳性;流产母猪PRV gB抗体的S/P值高达4.0,未流产母猪也达3.3。PCR检测3头病仔的脑组织均为阳性,测序表明其gB基因与2012年流行毒株BJ-YT-2012序列相似性为100%。ELISA检测免疫灭活疫苗前母猪血清PRV gB抗体S/P值为1.603,免疫4周后升高到2.88;特别是中和抗体从1∶24升高到1∶213。这与免疫疫苗1周后母猪流产开始减少,2周后母猪少见流产的结果吻合。研究结果提示,PRV经典株疫苗产生的PRV gB抗体对变异株的保护作用不佳,而变异株疫苗的保护效果显著。

福建省猪伪狂犬病病毒新流行株gD、gE基因遗传变异分析

为了解福建地区猪伪狂犬病病毒(PRV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律。本试验分离了2011-2013年福建省不同地区的11株PRV,并对其gD、gE基因进行遗传变异分析。结果表明,福建地区被检测的规模化猪场均存在野毒感染,病料接种PK-15细胞均能出现典型的细胞病变,分离的毒株接种家兔能出现典型的伪狂犬病症状。PRVgD、gE基因序列分析表明,自2011年福建地区PRV同源性较高且处于一个独立的分支,表明福建地区流行的PRV可能存在一定的抗原变异。

广西伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及遗传变异分析

为了更好防控广西伪狂犬病,本研究采集广西北海发生疑似伪狂犬病疫情（AD）猪场的犬和猪样品进行病毒分离,通过动物接种试验、电镜观察及核酸检测,证实分离到2株PRV毒株。2毒株与GenBank上登录的参考毒株gE和gC基因核苷酸序列同源性为97.4%~100.0%和91.3%~99.8%;氨基酸序列同源性为95.1%~100.0%和86.6%~99.5%。基于gE基因和gC基因的进化分析显示,2株分离毒与国内不同时期的毒株在进化树上共同构成一个进化分支,与欧洲和美洲的毒株亲缘关系较远。对氨基酸序列的分析结果显示,2株分离毒的gE基因决定毒力的关键位点未发生突变。基于gE蛋白质与gC蛋白质的分析结果显示,虽然与国外毒株（Rice和Bartha）相比存在多个氨基酸位点的变异,但与国内的分离毒,尤其是2011年后的流行毒株,变异情况基本一致。

伪狂犬病病毒荧光标签毒株构建及其在抗病毒药物筛选中的初步应用

为筛选针对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的有效抗病毒药物,本研究以PRV人源分离毒株hSD-1/2019和经典猪源流行毒株Ea为亲本病毒,采用同源重组技术将mCherry报告基因插入到PRV的UL 35基因终止子之前位点,构建了表达红色荧光蛋白mCherry的荧光标签毒株PRV-mCherry。基于构建的荧光标签病毒,以荧光强度为指标,建立高通量药物筛选平台,对天然产物库中1621种化合物进行抗病毒药物筛选,并初步探索药物特性。结果表明,mCherry标签插入位置正确且稳定遗传,荧光标签毒株PRV-mCherry与亲本毒株在PK-15细胞上的增殖曲线趋势一致,且荧光强度可反映病毒增殖情况。使用PRV-mCherry从天然产物库中成功筛选出3种可在体外有效抑制PRV增殖的药物,根据测定的50%细胞毒性浓度和50%抑制浓度,计算出3种药物的选择指数范围为203.63~564.58μmol·L^(-1),表明其具有良好的成药性。本研究为临床防治PRV感染的抗病毒药物发掘提供了新的策略和思路。

伪狂犬病病毒Guizhou-T1株的分离鉴定及其遗传变异研究

为了解贵州猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株的病原形态特征、致病性及遗传变异情况,本实验对收集自贵州规模化猪场伪狂犬病净化过程中PCR检测的阳性病料样品,采用细胞接毒分离培养、病毒的形态结构观察和易感动物接种试验对其病原进行鉴定。结果显示,本研究分离到一株PRV,命名为PRV Guizhou-T1株;并对其进行病毒效价的测定及g E基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示:PRV Guizhou-T1株gE基因序列与GZ-Z1株和Guizhou-DY株同源性分别为97.5%和99.3%,其TCID_(50)为10^(-10.11)/100μL;PRV Guizhou-T1株在gE基因编码的氨基酸序列第48和第496位均有天冬氨酸(Asp D)的插入,与PRV变异株变异位点一致,且在其第48位缺失酪氨酸(Tyr Y)。表明本研究分离得到了一株PRV变异株。本研究可为贵州PRV病原学的研究提供参考。

重组伪狂犬病病毒SA215(C)株的构建及其对小鼠的免疫原性

为了研制猪2型圆环病毒(PCV2)基因工程疫苗,以伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失疫苗株SA215为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达PCV2ORF2基因和绿色荧光蛋白基因重组伪狂犬病病毒SA215(C)株。经PCR、Southern blotting、Western blotting等证实SA215(C)构建正确,并能表达具有活性的ORF2基因蛋白和荧光蛋白。SA215(C)在IBRS-2、ST细胞中的增殖滴度与亲本株SA215相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响病毒增殖。用SA215(C)免疫BALB/c小鼠10周后检测免疫小鼠PCV2抗体和PRV中和抗体及细胞免疫反应。结果显示,SA215(C)诱导小鼠产生了PCV2和PRV抗体并出现PCV2的细胞免疫反应。另外,以105TCID50的SA215(C)株接种BALB/c小鼠,接种后28d再接种1次,2次接种后2周,用107TCID50PRVFa和PCV2强毒联合进行攻击,结果免疫小鼠抵抗住强毒的攻击,获得了保护;表明该毒株具有很强的免疫原性,为研制安全、有效的PCV2-PRV二价基因工程疫苗奠定了基础。

1株伪狂犬病病毒的基因变异及其对小鼠的致病性分析

本研究旨在了解我国猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)流行毒株的分子遗传变异及毒力特点。对1株分离自1个接种了Bartha-K61疫苗的规模猪场的PRV ZJ株进行了主要糖蛋白基因序列(gB、gC和gE)的测定分析及对6周龄BALB/c小鼠的致病性研究。遗传变异分析显示,该毒株与我国2012年后的流行毒株高度同源,具有变异毒株基因特征,但gE基因的510位氨基酸出现了不同于变异株的独特变化S^(510) G。ZJ株对小鼠具有较高的致病性,攻毒小鼠呈现典型的神经症状,以100 LD_(50)感染小鼠,第5天死亡率达100%。本研究为进一步探索该病毒的毒株变异特点与致病机理奠定基础。