顺铂联合重组人5型腺病毒腹腔灌注治疗胃癌合并恶性腹腔积液的临床疗效

目的探讨顺铂联合重组人5型腺病毒(H101)腹腔灌注治疗胃癌合并恶性腹腔积液的临床疗效。方法采用随机数字表法将68例胃癌合并恶性腹腔积液患者分为顺铂组(n=34,顺铂腹腔灌注)和顺铂联合H101组(n=34,顺铂联合H101腹腔灌注)。比较两组患者的腹腔积液缓解情况、腹腔积液间隔时间、生存情况、生活质量及不良反应发生情况。结果顺铂联合H101组患者腹腔积液总缓解率为73.5%,高于顺铂组患者的50.0%,差异有统计学意义(P﹤0.05)。顺铂联合H101组患者腹腔积液间隔时间为(34.02±9.79)天,明显长于顺铂组患者的(27.56±9.36)天,差异有统计学意义(P﹤0.01)。顺铂联合H101组患者的中位总生存期长于顺铂组(P﹤0.05)。两组患者的不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论顺铂联合H101腹腔灌注治疗胃癌合并恶性腹腔积液患者,能够安全有效地控制腹腔积液生成,改善患者的生活质量,延长患者的生存期。

表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒的构建与鉴定

为了构建出表达新布尼亚病毒(SFTSV)Gn基因的重组5型腺病毒,试验根据GenBank上发表的SFTSV Gn基因序列(登录号为ADZ04482.1)设计合成引物,采用特异性PCR方法在Gn基因前添加了KOZAK序列和tPA信号肽序列;然后通过酶切、连接等方法构建重组穿梭质粒PGA-KOZAK-tPA-Gn,与腺病毒骨架质粒pAd5-ΔE1ΔE3-5E4在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,得到重组腺病毒质粒rAd5-KOZAK-tPA-Gn,用PacⅠ酶酶切重组腺病毒质粒,并将线性化的质粒转染至HEK 293细胞中进行病毒包装、扩繁和纯化;采用PCR扩增、Western-blot等技术检测病毒基因的表达情况,并测定重组腺病毒效价。结果表明:通过PCR扩增获得了1 546 bp的KOZAK-tPA-Gn基因,并成功构建了重组穿梭质粒;SFTSV Gn基因在重组腺病毒传代过程中稳定存在;重组腺病毒在HEK 293细胞中表达出分子量约为61 ku的SFTSV Gn蛋白;测得重组腺病毒效价为1×10^(-7.63)/0.1 mL TCID_(50)。说明试验成功构建出表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒。

表达狂犬病毒糖蛋白基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其特性

目的构建表达狂犬病毒CVS-N2C毒株糖蛋白(GP)基因的复制缺陷型重组腺病毒,作为筛选狂犬病毒基因工程疫苗的基础。方法用大肠杆菌细胞内同源重组技术构建重组病毒;NorthernblotWesternblot和免疫荧光抗体等方法鉴定重组病毒。结果重组病毒具有典型的病毒形态;病毒基因组稳定;GP基因可被转录;重组病毒表达的GP蛋白相对分子质量为66000,与天然GP相对分子质量相符表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒免疫血清特异性识别;小鼠免疫-攻击试验可保护87.5%～100%动物。结论成功地构建了表达狂犬病毒CVS-N2C毒株GP基因的复制缺陷型重组腺病毒,并表现了良好的免疫效果。

重组复制缺陷型腺病毒基因治疗肝纤维化的研究与应用

肝纤维化的特征性变化是肝内细胞外基质的过多沉积.抑制肝星形细胞的激活和细胞外基质的合成,促进基质降解和肝细胞再生是肝纤维化治疗的重要方法.近年来,针对上述环节构建重组复制缺陷型腺病毒,表达不同外源基因产物基因治疗肝纤维化研究取得了较大的进展.本文对重组腺病毒的结构、构建以及抗肝纤维化作用和安全性研究作一综述.

复制缺陷型重组腺病毒rvAdG1VP7免疫学效果的研究

目的 对 1株可表达A组轮状病毒主要结构抗原VP7的重组腺病毒rvAdG1VP7的体内免疫学效果进行研究。方法 通过灌胃和滴鼻 2种途径对BALB/c小鼠进行免疫 ,并对免疫后小鼠体液和黏膜免疫进行分析。结果 初次免疫后 ,2组小鼠均有应答 ,但血清IgG抗体滴度及阳转率不同。再次免疫后 ,显示出明显的加强效果。除了血清IgG外 ,小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA。滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到SIgA ,灌胃组仅在肠道检测到SIgA。滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对滴鼻组小鼠肺灌洗液IgG/SIgA的阳转率进行了比较 ,发现IgG的应答水平明显高于SIgA。免疫后小鼠血清中IgG的动态观察表明 ,抗体可长期持续至少半年以上。 结论 重组腺病毒载体rvAdG1VP7所取得的良好免疫学效果 ,为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的进一步研制奠定了基础。

人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒。体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达。结果 成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL。体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达。结论 构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎冶疗奠定实验基础。

表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2;PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞,利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2;将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞,包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5 (rAd5-VP2),将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞(Vero、CEF和DF1细胞)并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养,测得第10代病毒的滴度为7.9×10~9 IFU/mL;RT-PCR结果显示,VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译;Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达,蛋白分子质量为41 ku;将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达,表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5,该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。

细菌内快速构建两种用于肝纤维化基因治疗的重组复制缺陷型腺病毒

目的 :在大肠杆菌内快速构建两种分别含有人肝细胞生长因子 (hepatic growth factor,HGF)和非分泌型人尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase- type plasm inogen activator,u PA) c DNA片段的重组复制缺陷型腺病毒。方法 :分别将人 HGF和 u PA c DNA片段与穿梭载体 p Track- CMV连接 ,线性化后与骨架载体 Ad Easy- 1在大肠杆菌 BJ5 183内同源重组获得腺病毒载体 p Ad HGF和 p Adu PA,经 2 93细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒 Ad HGF和 Adu PA;将 Ad HGF和 Adu PA分别体外感染肝细胞株 L0 2 ,以 Northern印迹法和 Western印迹法检测两种病毒在肝细胞中的表达。 结果 :连接、重组后通过酶切和测序法筛选出病毒质粒 p Ad HGF和 p Adu PA;经 2 93细胞包装 ,3d后均观察到绿色荧光蛋白明显表达 ,Cs Cl梯度离心纯化最终分别获得 4× 10 1 0 efu/ m l滴度的重组病毒 Ad HGF和 6× 10 1 0 efu/ ml Adu PA;两种病毒体外感染肝细胞 3d后 ,HGF和u PA表达均明显增加。结论 :细菌内同源重组制备复制缺陷型腺病毒 ,纯化过程简单 ,重组腺病毒在肝细胞中均高效表达 。

重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10构建及其在HSC中的表达

目的利用AdEasy系统构建重组复制缺陷型腺病毒AdIL 10 ,并观察其在肝星状细胞 (HSC)中的表达。方法从SD大鼠脾脏单核细胞中抽提总RNA ,通过RT PCR获得鼠IL 10cDNA片段 ,插入穿梭质粒pAdTrack巨细胞病毒 (CMV)启动子下游 ,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV IL 10 ,线性化后与AdEasy 1电穿孔共转化BJ5 183,获得重组腺病毒质粒pAdIL 10。pAdIL 10用Lipo fectamin包装转染HEK 2 93细胞 ,获得重组腺病毒AdIL 10。将AdIL 10体外感染HSC ,3d后抽提HSC总RNA ,以RT PCR检测IL 10的表达。结果通过酶切和测序法筛选出pAdIL 10 ;经 2 93细胞包装 ,3d后观察到绿色荧光蛋白 (GFP)表达 ;AdIL 10感染HSC3d后观察到GFP表达 ,通过RT PCR可检测到IL 10的表达。结论利用AdEasy系统可制备重组腺病毒AdIL 10 ;AdIL 10感染HSC后可表达IL

表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10^9 IFU·m^L^-1;经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。

人IL-2复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定

目的构建含hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。方法将hIL-2DNA片段与载体pDNR-Dual-CMV融合,转化大肠杆菌DH5α。得到重组质粒(pDNR-Dual-hIL-2),经鉴定正确,将pDNR-Dual-hIL-2质粒与pLP-Adeno-x-CMV质粒重组得到重组载体pLP-Adeno-hIL-2,再次转化大肠杆菌DH5α,挑取正确克隆,大量扩增,提取质粒。将此质粒经PacⅠ酶切后与LipofectamineTM2000转染HEK293细胞,产生含人IL-2的复制缺陷重组腺病毒(AdhIL-2)。结果pLP-Adeno-hIL-2重组载体经PCR、酶切鉴定结果与预期相符,所得重组病毒滴度达到5×107PFUml。结论成功构建了hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。

猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原共表达的复制缺陷型重组腺病毒构建及鉴定

通过RT-PCR技术和重叠PCR技术扩增出含有猪传染性胃肠炎病毒S基因的A抗原表位和D抗原表位,构建复制缺陷型腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经PacI线性化之后,共同转染AD-293细胞,获得共表达A、D抗原表位的复制缺陷型重组腺病毒。经Western Blotting检测,该重组腺病毒能够正确表达目的蛋白基因,而且目的蛋白能够与猪传染性胃肠炎阳性血清反应。本研究结果为猪传染性胃肠炎重组疫苗研发奠定基础。

表达PCV2 Cap蛋白重组复制缺陷型腺病毒黏膜免疫效果

为研发高效的猪圆环病毒2型(PCV2)黏膜疫苗,通过口服、肌内和滴鼻途径,将表达PCV2 Cap蛋白主要抗原表位的重组复制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)免疫Balb/c小鼠,同时以无外源基因的空腺病毒(wild-rAd)经滴鼻途径免疫Balb/c小鼠作为对照组,分别检测小鼠血清中IgG和唾液、肺部、肠道灌洗液中IgA抗体水平,脾脏T淋巴细胞亚群及相关细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平以及淋巴结、脾脏和肺组织中PCV2病毒载量,评价其黏膜免疫效果。结果显示,与对照组相比,rAd/Cap/518经肌内途径免疫诱导产生的血清IgG抗体水平显著增加;经滴鼻和口服途径免疫诱导产生的局部黏膜部位IgA抗体水平显著增加。rAd/Cap/518经滴鼻、肌内和口服3种途径免疫诱导产生的CD3+T细胞百分率为46.60%~55.65%,经滴鼻免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为34.43%~37.29%,经肌内和口服途径免疫诱导产生的CD3+CD4+T细胞百分率为36.35%~41.58%,经滴鼻途径免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为12.39%~18.32%,经口服免疫诱导的CD3+CD8+T细胞百分率为16.29%,均显著高于对照组。rAd/Cap/518经滴鼻途径免疫后,能诱导小鼠脾脏和肠系膜淋巴细胞分泌IFN-γ。攻毒后免疫鼠体内病毒载量显著降低。综上,rAd/Cap/518经肌内途径免疫主要诱导全身性免疫应答,经滴鼻和口服途径免疫能诱导全身性和局部黏膜免疫应答,是一种很有前景的黏膜免疫候选疫苗。

表达大熊猫源犬瘟热病毒H蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

为构建能够表达大熊猫源犬瘟热病毒(CDV)分离株giant panda/SX/2014 H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增株giant panda/SX/2014 H基因,通过TOPO连接克隆至入门载体pENTR/D-TOPO,得到重组入门质粒pENTR/D-TOPO-CDV-H,然后与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST进行LR重组,获得重组质粒pAd-CDV-H;重组质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-CDV-H,连续传代后对获得的重组腺病毒分别进行病毒滴定、免疫荧光和Western blot鉴定。经免疫荧光方法及Western blot鉴定结果表明,重组腺病毒rAd-CDV-H感染293A细胞、Vero细胞后均可以成功表达H蛋白,获得的重组腺病毒的滴度高达1010IFU/mL。成功获得能够表达大熊猫源CDV H蛋白的重组腺病毒rAd-CDV-H,在进一步证明其安全有效后,可为大熊猫犬瘟热免疫预防提供候选疫苗株。

胸腔内注射重组人5型腺病毒治疗晚期肺癌恶性胸腔积液的疗效观察

目的:观察胸腔内注射重组人5型腺病毒(安柯瑞)治疗肺癌恶性胸腔积液的有效性和安全性。方法:将我院52例肺癌恶性胸腔积液患者随机分为安柯瑞治疗组(26例)和顺铂对照组(26例),胸腔内分别注射安柯瑞或顺铂,观察治疗有效率、不良反应。结果:安柯瑞治疗组和顺铂对照组治疗有效率分别为69.23%及53.84%,两组间比较具有显著差异(P<0.05),两组均出现不同程度的白细胞减少,但较之顺铂对照组,安柯瑞治疗组不良反应明显较轻。结论:安柯瑞胸腔内注射治疗晚期肺癌恶性胸腔积液疗效较好,毒副反应轻。

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack CMV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E.coliBJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Westernblot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1∶10000和1∶1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100%。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。

复制缺陷型HCV C基因腺病毒表达载体的构建包装及鉴定

目的:构建能表达HCVC基因的复制缺陷型腺病毒表达载体.方法:将HCVH株C区基因定向插入到腺病毒穿梭质粒pAd.CMV-Link.1中,获得重组质粒pAd.HCV-C,再与pJM17共转染293细胞,包装腺病毒表达载体.通过酶切、PCR及测序对穿梭质粒进行了鉴定.对腺病毒载体进行了感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.利用间接免疫荧光法和Westernblot检测了腺病毒载体在人肝癌细胞HepG2中的表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HCVC区基因.包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HCVC区基因,并可以在HepG2细胞中表达HCVC抗原.结论:包装成功的复制缺陷型腺病毒载体可以在HepG2细胞中表达HCVC抗原,为丙型肝炎的基因治疗及疫苗的进一步研究奠定了基础.

依托泊苷提高复制缺陷型腺病毒介导外源基因在肿瘤细胞中的表达水平

目的：研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法：携带外源基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP（MOI为1或10）单独或联合终质量浓度为0．2、2、20、40、80、100和200μg／ml的依托泊苷感染体外培养的肿瘤细胞NCI-H446（人非小细胞肺癌细胞株）、A549（人肺腺癌细胞株）、SMMC-7721（人肝癌细胞株）、SGC7901（人胃癌细胞株）、SKBR-3（人乳腺癌细胞株）和BTT（小鼠膀胱移行上皮癌细胞株）后不同时间，流式细胞仪分析肿瘤细胞EGFP阳性率和平均荧光强度，Western blotting检测EGFP蛋白表达，RT—PCR和实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞内EGFP的mRNA表达量和DNA拷贝数。结果：不同剂量的依托泊苷可不同程度地提高Ad5-CMV-EGFP在7种肿瘤细胞内的表达水平，但对EGFP阳性率无明显提高。10 MOI的Ad5-CMV-EGFP联合40μg／ml依托泊苷分别感染肿瘤细胞NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SKBR-3和BTT 24h后，细胞内EGFP的荧光强度分别是单独感染的3．3、3．5、3．1、6．2、7．0、5．4和3．4倍。Ad5-CMV-EGFP联合应用依托泊苷后肿瘤细胞内EGFP蛋白表达增加2～5倍，EGFP mRNA表达量提高，但DNA拷贝数未见明显改变。结论：依托泊苷可提高腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平，该作用可能是在转录水平上发挥作用的。