重组多功能抗凝多肽的表达及活性测定

目的 探讨多功能抗凝多肽基因的克隆、表达的可行性及其活性的测定。方法 设计一个具有双重抗凝功能的重组多肽分子结构 ,它由谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)作为载体蛋白与重组抗凝多肽融合而成。编码重组抗凝多肽的DNA序列是根据氨基酸序列逆向翻译后经人工合成 ,并插入表达质粒pGEX 5X 3中 ,与其中的编码GST序列的 3′端融合。采用大肠杆菌DH5α进行原核表达。应用亲和层析的方法得到纯化的融合蛋白。重组抗凝多肽含有 31个氨基酸 ,由 3个功能部分组成 :(1)Lys Gly Asp(KGD)氨基酸序列 ,可抑制血小板GpⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原的结合 ;(2 )纤维蛋白单肽A的 7 16残基 (FBA7 16) ,是凝血酶的抑制剂。 (3)水蛭素C末端的 12肽 ,可直接抑制凝血酶。结果 纯化的融合蛋白能抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集 (10 0 μmol/L时其活性为对照组的 2 0 7% ) ;随浓度增加而显著延长部分凝血活酶时间 (80 μmol/L时凝血活酶时间为 74 7s)和凝血酶时间 (80 μmol/L时为 10 2 3s)并抑制凝血酶的蛋白酶分解活性 (10 0 μmol/L时活性为对照的 11% )。同时 ,也发现GST也有抗血小板作用 ,但其作用要明显弱于融合蛋白。