灭活剂对BL21-(PET28a-HA9801)灭活下游工艺影响的研究

目前国内生产的有效预防猪链球菌疾病的有效亚单位疫苗,是采用大肠杆菌重组蛋白作为抗原,在大肠杆菌发酵后的灭活工艺环节,多采用灭活剂甲醛进行重组大肠杆菌的灭活,灭活效果良好,但是对于下游蛋白纯化工艺的影响没有相关报道研究,为了研究灭活剂甲醛对于猪链球菌重组大肠杆菌BL21-(PET28a-HA9801)表达蛋白纯化收率影响。本研究利用猪链球菌重组大肠杆菌BL21-(PET28a-HA9801)进行菌培养,利用试验组0.2%甲醛灭活和对照组无甲醛灭活,分别进行菌体破碎,蛋白纯化,比较试验组和对照组,在蛋白纯化过程及蛋白纯化后蛋白得率进行对比分析,结果表明,试验甲醛添加组对与菌体破碎效果及亲和层析纯化、蛋白得率都有显著影响,因此得出结论甲醛对于猪链球菌重组大肠杆菌BL21(PET28a-HA9801)灭活效果良好,但是对于下游纯化蛋白收率影响较大,不适宜作为猪链球菌重组大肠杆菌BL21(PET28a-HA9801)灭活的最佳灭活剂。

重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题.考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响.结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行;底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都显著降低;高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用.