草鱼丝氨酸蛋白粗酶的提取、酶学特性及大豆胰蛋白酶抑制剂对其活性的影响

【目的】探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)粗酶的提取方法、酶学特性,以及大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对草鱼鱼糜凝胶品质的影响,为改善传统草鱼鱼糜制品品质提供理论基础。【方法】从草鱼背肌中提取MBSP粗酶液,探究提取过程中漂洗次数(1~5次)、热处理温度(35、40、45、50、55℃)、酸洗脱pH值(pH 4.0、pH 5.5)对提取液酶活性的影响,获得最佳提取条件;设置梯度实验探究所得酶的最适温度、pH、稳定性等酶学特性,最后探究大豆胰蛋白酶抑制剂对粗酶酶活性的影响及其对草鱼鱼糜凝胶性能的调控。【结果及结论】经3次漂洗、45℃热处理、pH 4.0酸洗脱后得到的草鱼MBSP粗酶液酶活性最高(P<0.05);所得MBSP最适pH值在9.0附近,最适温度为45℃,具有较好的温度稳定性(P<0.05),其活性可被Na^(+)在一定程度上抑制且被K+、Ca^(2+)激活(P<0.05);STI添加可以显著改善草鱼鱼糜质构,其对草鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶有可逆竞争性抑制作用,半抑制质量浓度为10.85μg/mL,抑制常数Ki=0.24μmol/L。

大豆胰蛋白酶抑制剂对肉鸡生长和肠道健康的影响

近年来,随着我国畜禽养殖业向“限抗”“禁抗”“替抗”的转变,肉鸡的肠道因失去抗生素的保护而变得非常脆弱,肠道健康问题成为当前肉鸡养殖户关注的热点问题。豆粕作为肉鸡饲粮中主要的蛋白质来源,豆粕中同样含有抗营养因子—大豆胰蛋白酶抑制剂,可损害肉鸡肠道健康。因此,通过总结胰蛋白酶抑制剂的概念及其对肉鸡生长和肠道健康的影响,以期为合理利用豆粕及改善肉鸡肠道健康提供参考。

大豆胰蛋白酶抑制剂对家禽生长和肠道健康的影响

随着家禽养殖业的快速发展,饲料中常添加大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitors,SBTI)以提高家禽的生产效率。然而,大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)在促进家禽生长的同时,也可能对其肠道健康产生不利影响。本文分析了大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)的来源及作用机理,并系统评估了其对家禽生长性能和肠道健康的影响,提出了一套安全使用策略。

重组Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂的性质及抑制机理

利用大肠杆菌表达系统,成功表达并纯化获得了重组Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂(rBBTI)。对比研究了天然Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(BBTI)和rBBTI的酶学性质和稳定性,以及分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制动力学。结果表明:rBBTI和BBTI都有较好的热稳定性,pH对rBBTI的活性影响较大;rBBTI和BBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适条件分别为pH 8、25℃和pH 9、16℃;二者的抑制机理相同,抑制胰蛋白酶时表现为典型的反竞争性抑制作用,而抑制糜蛋白酶时表现为典型的非竞争性抑制作用;rBBTI和BBTI对胰蛋白酶的抑制效率均高于对糜蛋白酶的抑制效率,但rBBTI抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的效率略低于BBTI。

大豆胰蛋白酶抑制剂对棉铃虫幼虫消化生理和生长发育的影响

本研究根据棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈｕｂｎｅｒ）幼虫中肠蛋白酶在离体条件下对蛋白酶抑制剂的反应，选择具有较强抑制作用的大豆胰蛋白酶抑制剂，以０．２１—４．２％（干重）的浓度配入幼虫人工饲料，测定了幼虫短期和长期取食这些饲料引起的中肠类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力的变化和生长抑制效应。短期取食抑制剂的幼虫，中肠弱碱性类胰蛋白酶活力显著增高，在４．２％浓度下比对照高出２１％强碱性类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低，生长发育受到明显抑制。长期取食低浓度（０．８４％）抑制剂的幼虫，弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力显著增高，强碱性类胰蛋白酶活力显著降低．总蛋白酶活力变化不显著；长期取食高浓度（４．２％）抑制剂的幼虫，强碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低，其它酶活力变化不显著。抑制剂随浓度的增高对幼虫生长的抑制作用加强，但浓度高于０．８４％后，抑制强度的变化减小。据此作者认为，蛋白酶抑制剂对昆虫抗营养效应在于它对蛋白酶的激活和抑制作用，从而导致各种蛋白酶间的协调性破坏，昆虫消化过程受阻，影响生长发育。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探

从未成熟的大豆子叶中提取总RNA，利用RT－PCR方法扩增出大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因单一目的片段，克隆到pBluescriptKS（＋）SmaI位点上。序列分析表明，该基因与报导的序列高度同源：其核苷酸序列及推论的编码氨基酸序列的同源率分别为99．5％和98．2％。由此，构建了大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的植物高效表达载体pBinSKTI。并采用农杆菌介导的叶盘法转化了烟草，获得的转基因烟草再生植株经抗虫测试表明：与对照烟草相比，具有明显的抗棉铃虫能力。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用

大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗虫特性。从未成熟的大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）子叶中提取总ＲＮＡ，然后反转录成单链ｃＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因，并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）的ＳｍａⅠ位点上。序列分析表明：克隆片段大小为６６３ｂｐ，包含了基因完整的编码序列。编码多肽由２１７个氨基酸组成，其中包括Ｎ端２５个氨基酸组成的信号肽序列，１８１个氨基酸组成的成熟蛋白序列和Ｃ端１１个氨基酸组成的液泡定位信号序列。构建了此基因的一系列植物表达载体，用于烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、棉花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）等作物的转化。利用棉铃虫（ＨｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａＨｕｂｎｅｒ）对经ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交验证获得的转基因烟草进行了抗虫测试，结果表明，转基因烟草和对照烟草相比，具有明显的抗虫能力。

大豆胰蛋白酶抑制剂对鲢丝氨酸蛋白酶的作用

研究了大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对鲢肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)引起的肌原纤维蛋白降解作用的影响。大豆胰蛋白酶抑制剂经高度纯化后加入肌原纤维中以判断它对MBSP的抑制效果。在不添加STI的情况下,55℃加热30min即可观察到肌球蛋白重链的分解,延长加热时间则可检测到肌动蛋白及原肌球蛋白的降解。相反,在终浓度为0.75μg·mL-1的STI存在下,包括肌球蛋白重链在内的肌原纤维蛋白降解均能得到有效抑制,表明STI是MBSP的特异性抑制剂。由于肌球蛋白重链及肌动蛋白的完整性是构成鱼糜制品凝胶强度的主要因素,因此,STI的添加有可能提高鲢鱼糜制品的凝胶强度。

大豆脂肪氧化酶及Kunitz胰蛋白酶抑制剂缺失种质的创新

脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂是大豆蛋白中 2种重要的抗营养因子。以黄淮海主栽品种鲁豆 4号、中品661、豫豆 8号、91D15、潍 8640作母本,美国引进缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂品种P.I.L83 4387和优良品种Century缺失脂肪氧化酶的近等位基因系Century 2、Century 2. 3和Century 1. 3作父本进行有性杂交,利用大豆脂肪氧化酶缺失基因及胰蛋白酶抑制剂缺失基因的生化标记对杂种后代进行多年辅助选择,培育脂肪氧化酶缺失基因 (lx1、lx2、lx3 )、胰蛋白酶抑制剂缺失基因(ti)等优质多基因聚合的大豆新种质,为我国大豆品质育种、生产及加工利用提供优异种质材料。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的促凋亡作用

为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝胶电泳法检测HL-60细胞的凋亡,用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL-60细胞后引起的凋亡现象。结果表明:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100μg/ml重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导细胞凋亡,这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据,也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。

大豆中植酸和胰蛋白酶抑制剂的抗营养和抗癌效应

大豆是重要的油料作物和植物蛋白来源,富含植物化学物质,如植酸和胰蛋白酶抑制剂等。传统营养理论认为这些植物化学物质是抗营养因子,然而近来研究显示这些化学成分具有天然抗癌作用。以植酸和STI为例主要介绍了它们的结构、分布、生理活性、抗营养效应及抗癌效应。

大豆胰蛋白酶抑制剂的研究进展

从结构、毒理学分析和灭活方法3个方面对国内外近年来对大豆胰蛋白酶抑制剂的研究进展进行了综述。

Alcalase蛋白酶降解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究

研究了不同酶解条件下 (pH值、温度、时间、加酶量和添加巯基还原剂 ) ,碱性内切蛋白酶Alcalase对大豆蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂的降解作用。研究结果表明 ,Alcalase可同时降解大豆蛋白和胰蛋白酶抑制剂。该酶解反应的最适条件为 :pH 8 0、温度 6 0℃、最适加酶量 10 μL/g蛋白 (约 0 0 2 832AU/ g蛋白 ) ,添加Na2 SO3为ω(Na2 SO3) =0 3% ,水解时间 4h。在此条件下 ,残留胰蛋白酶抑制活性为对照的 2 0 % ,可溶性蛋白含量可达 2 7mg/mL ,游离氨基酸含量为 7 1mg/mL ,大豆蛋白的水解度为 8 9%。

大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义+正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)研究进展

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂 (SKTI)是一种典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂 ,主要集中在大豆的子叶中。近 60年来 ,对其生化特性及结构已有较多研究 ,通常认为这种蛋白酶抑制剂具有贮藏、调节内源蛋白酶活性及植物防御等作用。研究表明 ,这种蛋白酶抑制剂抗虫谱广 ,能显著抑制幼虫的生长发育不易产生抗性 ,对人畜无害 ,因此对其进行研究及开发利用具有重要的经济和社会效益。迄今为止 ,至少已有 4种基因被克隆 ,通过转基因技术在烟草、水稻、小麦等作物获得了抗性植株 .本文从SKTI的类型、基因克隆及生理功能等方面作一简单综述。

大豆发芽过程中异黄酮、维生素C、胰蛋白酶抑制剂含量变化的研究

为了研究大豆在发芽过程中异黄酮、维生素C、胰蛋白酶抑制剂的变化,选用高脂肪、高蛋白和普通大豆品种为实验材料,分别采用紫外分光光度法、2、6-二氯酚靛酚法进行测定。结果表明,大豆发芽期间,异黄酮和维生素C的含量均有所上升,胰蛋白酶抑制剂含量则有所下降。其中高脂肪(垦农29)、高蛋白(垦农30)和普通大豆(黑农53)在发芽96h左右时异黄酮含量最高,分别上升至未发芽大豆的3倍、3倍、5倍;而维生素C则由干大豆中的0mg/100g分别上升到120h的12.572、12.753、12.361mg/100g;而胰蛋白酶抑制剂的含量则分别降至0.36、0.44、0.39mg/g。由此得出,大豆发芽的最佳发芽时间为96h。

缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶2.3的大豆新品种——中黄16的选育

大豆新品种中黄 16 (原名中作 96 - 95 2 ) ,是中国农业科学院作物育种栽培研究所利用缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂的高产、优质、抗花叶病毒病 (SMV)的高代材料ti15 176作母本 ,美国引进优良品种Century近等基因系、脂肪氧化酶缺失的优质材料Century - 2 3作父本进行有性杂交 ,采用未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE)技术及等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 (IEF PAGE)技术 ,对杂种后代胰蛋白酶抑制剂 (Ti)、脂肪氧化酶 (Lox)进行缺失检测及多年辅助选择育成。该品种于 1999～ 2 0 0 0年参加北京市夏播大豆区域试验 ,2 0 0 1年参加北京市夏播大豆生产试验 ,2 0 0 2年 4月通过北京市品种审定委员会审定。其突出特点是高产、稳产、优质 (蛋脂双高、蛋白质含量高且蛋白质品质优异———缺失Ti和Lox2 3)、抗花叶病毒病、综合性状优异。是国内第一个缺失Kunitz胰蛋白酶抑制且缺失脂肪氧化酶 2 3的三缺 (Lox 2 3,ti)优质大豆新品种。

大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。

山东产野生大豆胰蛋白酶抑制剂的初步研究

该实验建立了HPLC测定大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)活性的方法,并对山东产野生大豆(G.soja)与同地区产的黑豆和黄豆(G.max)的胰蛋白酶抑制活性差异进行了比较。用耦合了胰蛋白酶的亲合色谱柱对野生大豆的STI进行分离纯化,紫外分光光度法比较3种大豆的STI含量;PCR结合TA克隆技术对野生大豆STI中的Kunitz型(KSTI)蛋白基因编码区的氨基酸顺序进行初步测定。结果发现,山东产野生大豆的STI活性和含量均高于同地区产的黑豆和黄豆;山东产野生大豆的KSTI蛋白基因编码区的氨基酸顺序与已知的Tia型基本一致,仅第59位氨基酸由于单核苷酸的置换发生了Ser→Thr的转变,此位置位于活性中心附近。研究表明,山东产野生大豆胰蛋白酶抑制活性较强,且含量高。

缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶2的大豆新品种中黄31的选育

大豆新品种中黄31是中国农业科学院作物科学研究所利用缺失Kun itz胰蛋白酶抑制剂的高产、优质、抗花叶病毒病(SMV)的高代材料ti15176作母本,美国引进优良品种Century近等基因系、脂肪氧化酶缺失的优质材料Century-2.3作父本进行有性杂交,采用未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)技术及等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)技术,对杂种后代胰蛋白酶抑制剂(Ti)、脂肪氧化酶(Lox)进行缺失检测及多年辅助选择育成。该品种于2005年通过北京市品种审定委员会审定。其突出特点是高产、稳产、优质(蛋白质品质优异?缺失Ti和Lox2)、抗病、抗倒、综合性状优良。