毕赤酵母Mut^+和Mut^s重组子表达美洲商陆抗病毒蛋白基因的比较

将N末端信号肽和C末端毒性区域缺失突变的美洲商陆抗病毒蛋白 (pokeweedantiviralprotein ,PAP)基因表达载体pPIC9K P酶切线性化后 ,通过电击转化整合到巴氏毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115菌株细胞中 ,PCR筛选出表型为利用甲醇快速型(Mut+ )的重组子。在相同培养条件下比较Mut+ 重组子和利用甲醇缓慢型 (Muts)重组子在表达缺失突变型PAP方面的异同。结果表明 ,诱导培养 4 8h后 ,Mut+ 重组子表达产物在SDS PAGE胶上可见清晰目的带 ,而Muts 重组子培养 72h才能见到微弱的目的带。抗病毒活性实验表明Mut+ 重组子和Muts 重组子的表达产物均对TMV病毒侵染有明显的抑制作用 。

毕赤酵母Mut^+和Mut^s重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较

将本实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓慢型的重组子(His+Muts)。在相同培养条件下比较甲醇利用缓慢型的重组子和Mut+重组子在表达植酸酶方面的异同。实验结果表明,诱导表达48h后,Mut+和MutS重组子表达的产物在SDS-PAGE胶上都出现了清晰的目的带。酶学性质测定表明,酶学性质无显著差异。

毕赤酵母Mut^+和Mut^s重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较

将重庆市草食家畜与牧草重点实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓慢型的重组子(His+Muts)。在相同培养条件下比较甲醇利用缓慢型的重组子和Mut+重组子在表达植酸酶方面的异同。实验结果表明,诱导表达48h后,Mut+和Muts重组子表达的产物在SDS-PAGE胶上都出现了清晰的目的带。酶学性质测定表明,酶学性质无显著差异。

一种简便快速筛选重组子的方法

将转化后的单菌落置于快检缓冲液中,振荡后,直接通过琼脂糖凝胶电泳比较质粒大小,2 h内可筛选出重组子.详细介绍了快检缓冲液配方、快检效果、注意事项以及与其它方法的优势比较.

一种简便快速筛选重组子的方法

目的:根据碱裂解法抽提质粒DNA的原理,研究应用快检缓冲液方法挑取重组子克隆,从而获得简单易行,快速方便,节省时间,提高工作效率的筛选重组子的方法。方法:不需抽提质粒,只要将菌落接入快检缓冲液后直接进行普通琼脂凝胶电泳分析,就可以快速筛选出重组子。结果:结果和提取质粒酶切鉴定结果一致。结论:经实验证明用快检缓冲液方法筛选重组子是一种简单易行,快速方便,节省时间,提高工作效率并且可靠的方法。

人DNA聚合酶β基因靶向RNA干扰重组子克隆及序列分析

目的克隆用于人DNA聚合酶β(DNApolymerasebeta,Polβ)基因靶向RNA干扰的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)寡核苷酸绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFPC1pU6dsRNA”,为进一步研究人Polβ基因在环境化学污染物所致的DNA损伤修复中的作用机制作准备。方法依据Genbank中人polβ基因的cDNA序列,运用dsRNAoligonucleotidedesigner设计出用于RNA干扰用的dsRNA寡核苷酸序列,并以化学方法合成之。通过重组DNA技术将合成好的dsRNA克隆到含人pU6启动子的pSIRENRetroQ逆转录病毒载体上,以此重组子转化感受态E.coliDH5α,经氨卞青霉素筛选后进行扩增,并抽提质粒。运用EcoRⅠ和BglⅡ消化并回收“pU6dsRNA”目的片段,再将“pU6dsRNA”亚克隆到pEGFPC1上,获“pEGFPC1pU6dsRNA”重组子,并进行酶切鉴定和序列分析。结果经酶切鉴定发现,“pEGFPC1pU6dsRNA”载体重组子处于预期条带位置,序列分析显示与所设计的目的片段序列完全相符。结论作者克隆了用于人Polβ基因靶向RNA干扰的dsRNA绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFPC1pU6dsRNA”,为进一步研究Polβ基因功能作好了准备。

一种挑取重组子克隆的简易方法

本研究应用菌落ＰＣＲ 方法挑取重组子克隆，简单易行，可减少提取质粒的工作量，使繁重的实验工作得以简化。

一种碱裂解菌液直接电泳快速筛选重组子的方法

目的 :从碱裂解法提取质粒DNA的原理 ,经过实验摸索获得一种快速、经济、结果可靠的菌液直接碱裂解电泳筛选重组子的方法。方法 :不需提取质粒DNA ,只需将细菌培养液碱裂解后直接进行普通琼脂糖凝胶电泳分析 ,就可以快速筛选出转化重组子。结果 :结果和提取质粒酶切鉴定鉴定结果一致。结论 :经实验证明菌液直接碱裂解电泳筛选重组子是一种快速、经济、可靠的方法。

人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建

本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制。方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829bp和784bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnI/EcoRI对获得的2个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3Basic荧光素酶报道重组子;经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400bp左右设计了5对3′端平齐、5′端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112bp、1 703bp、1 290bp、784bp和496bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定。结论:成功克隆了长度为2.5kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pGL3-Basic荧光素酶报道重组子。

一种获取巴斯德毕赤酵母高拷贝重组子的新方法

目的 :探讨一种简化的高效获取用于表达重组蛋白的巴斯德毕赤酵母高拷贝重组子的新方法 ,即多重转化筛选法。方法 :按经典方法转化宿主菌和利用G4 18多拷贝筛选法从转化子中筛选出含目的基因表达盒拷贝数最高的菌株 ,然后以之作为新一轮的转化宿主菌。如此重复进行数轮上述转化筛选过程 ,直到获得含有尽可能多拷贝目的基因表达盒的重组子 ;同时将此方法 ,即多重转化筛选法与经典方法进行比较。结果 :与经典方法相比 ,多重转化筛选法通过筛选较少量转化子即可轻而易举地获得较多的高拷贝重组子 ,工作量更小 ,效率更高。结论 :多重转化筛选法是一种更高效地获取毕赤酵母高拷贝重组子的新方法。

PCR对ES细胞定点整合重组子的鉴定

ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）是一种对ＥＳ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍ）细胞定点整合重组子进行鉴定的有效方法。由于在定点整合重组子和非定点整合重组子中外源导入基因与基因组ＤＮＡ分子整合的方式各不相同。因此，非重组子、定点整合重组子和非定点整合重组子的基因组ＤＮＡ分子结构也将各不相同。当我们设计合适的引物，从ＰＣＲ扩增结果中即可分析、鉴别出定点整合重组子、非定点整合重组子、或非重组子。本文采用ＰＣＲ方法，根据ｐＲＶ４．０质粒转化ＥＳ细胞（雄性小鼠ＣＣＥ株系）后的不同类型转化子细胞基因组ＤＮＡ分子的特点，设计了两对不同的引物，分别对转化细胞经抗Ｇ４１８，６ＴＧ初步筛选的克隆进行了分析，从中快速、简便、特异性极强地得到了定点整合重组子。我们还用ｓｏｕｔｂｅｒｎ杂交验证了这种方法的准确性。

类产碱假单胞菌酪氨酸酶基因重组子所产黑色素性质的研究

将构建的含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的重组质粒导入从自然病死蝇蛆体内分离的具有显著杀蛆作用的类产碱假单胞菌体内 ,使后者获得了稳定产生黑色素的能力 ,具有很强的抗辐射作用。所产黑色素是无定形物质 ,在大多数有机和无机溶剂中溶解度低或不溶解 ,在碱性溶液中有较好的溶解性 ,在中性及弱酸性溶液中溶解度低 ,在pH <4的溶液中沉淀 ;可用过氧化氢或次氯酸钠氧化 ,也能被银离子或硫化氢还原 ;含有自由基 ,并能清除由紫外线诱导产生的自由基 ;能吸收所有波长的光线 ,在紫外波长下吸收值最大 ,能有效地保护紫外辐射对蛋白质及DNA等生物大分子物质的损害。

含小插入片段重组子筛选鉴定方法之探讨

基因工程中，重组ＤＮＡ时，当外源ＤＮＡ很小并与载体相差很大时，其目的重组子的筛选鉴定工作不仅量大，而且常规鉴定方法无法采用。本文针对此类重组子的鉴定方法作了探讨，提出了三级四步筛选鉴定法，即：质粒筛选、重组鉴定、目的重组鉴定和双酶切鉴定。该法不仅有效地解决了国内普通实验条件下含小插入片段重组子的鉴定问题，大大缩小鉴定范围，而且快速省耗的鉴定方法也为ｐＧＥＸ载体系统的更广泛应用提供了新的启示。

亮氨酸拉链结构蛋白在大肠杆菌重组子中的表达(英文)

酵母转录因子 GCN4是通过亮氨酸拉链 (b ZIP)结构结合 DNA的蛋白质之一 ,当 GCN 4二聚体与 DNA结合时 ,亮氨酸拉链区的 2个单体结合为平行的卷曲螺旋结构 ,而其基区由无规线团结构变为α螺旋 .为探讨亮氨酸拉链蛋白与 DNA的结合机理 ,设计了含有 GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合 DNA的必需氨基酸的折叠片段 ,并将其克隆到 Escherichia coli BL 2 1,讨论了此亮氨酸拉链蛋白的表达条件 .在蛋白质的小量表达试验中 ,重组子 Es-cherichia coli BL 2 1于 5 m L含有 5 0μg/m L氨苄青霉素和 34μg/m L氯霉素的 L B液体培养基中培养至对数期 ,加入不同浓度的 IPTG,继续培养以诱导蛋白质的表达 ,在不同的时间 (如 :诱导前 ,诱导 2 ,4 ,6 ,8h)取样 10 0μL到1.5 m L离心管中、离心收集沉淀 ,将沉淀悬浮于样品缓冲液中 ,用 10 % SDS- PAGE检测 ;在 10 L含氨苄青霉素和氯霉素的 L B液体培养基中进行了大量表达 ,根据小量表达的试验结果确定了 IPTG的浓度和诱导时间 .结果表明 :含有这种拉链蛋白质的重组子 Escherichia coli BL 2 1在 37℃下小量培养时 ,0 .1～ 0 .8mm ol的 IPTG均可在 2～ 10 h内诱导该蛋白质表达 ;而大量培养时 ,0 .2 m mol和 0 .4 mm ol的 IPTG在 37℃均不可能诱导表达 ,只在2 8℃时才表达 ;

微生物融合重组子的鉴定——DNA分子检测技术

融合子是双亲融合的产物，必然带有双亲的分子标记，因此ＤＮＡ水平上的分子标记是鉴别融合子最可靠的指标。生物群体中等位基因的差异导致遗传多样性，它形成的分子基础是基因组ＤＮＡ序列变异。在生物基因组中，还存在大量不编码ＤＮＡ序列，它们是中性的，在进化过程中...

小片段DNA阳性重组子的快速筛选

PCR扩增的小片段DNA用T载体连接,转化受体菌后观察不到典型的蓝/白斑。用插入片段的特异性引物对菌落进行PCR来筛选阳性重组子,测序鉴定结果吻合率达100％,说明当利用颜色特性挑选阳性克隆成为困难时,菌落PCR技术是一种简便、快速、可靠的筛选方法。

质粒DNA的快速提取及其在重组子大量筛选中的应用

[目的 ]介绍一种质粒DNA的快速提取方法及其在重组子大量筛选中的应用。[方法 ]利用微量碱变性一步法快速提取质粒DNA。[结果 ]应用该法能在大量的重组菌株中筛选出所需的重组质粒。[结论 ]本法便捷、经济 。

PCR技术在鉴定阳性重组子中的应用

阳性重组子的筛选与鉴定是分子克隆实验中经常遇到的一个重要问题。DNA片段连接产物转化感受态大肠杆菌后经相应抗生素抗性粗筛后,为了鉴定转化子中插入片段的存在,目前常采用的方法有:①通过特异探针从菌落原位杂交筛选。②通过快提质粒DNA后,依据分子量大小及酶切图谱进行鉴定。但这两种方法均存在各自的不足。如:周期较长,需进行同位素操作。

一种利用碱裂解法快速筛选重组子的方法

根据碱裂解法提取质粒DNA的原理,利用碱裂解法快速筛选到重组子,该方法快迅、准确,可应用于基因克隆中的重组菌落快迅检测。