蛇毒类凝血酶安克洛在毕赤酵母中的表达

目的:利用毕赤酵母表达具有生物学活性的蛇毒类凝血酶安克洛。方法:根据已知的天然安克洛的氨基酸序列,结合酵母偏好密码子,设计并合成了安克洛基因序列,将其克隆至表达载体pPIC9中,得到表达质粒pPIC9/Ancrod,电转至毕赤酵母GS115(His-)菌株感受态中,通过表达筛选获得工程菌株。采用5L发酵罐对工程菌进行发酵,表达安克洛。在诱导表达阶段,补加甲醇-山梨醇混合碳源。经疏水柱、肝素亲和柱和阳离子柱三步分离纯化得到重组安克洛,并鉴定其体外生物学活性。结果:重组安克洛表观相对分子质量为43000～48000,其糖基化不均匀,去糖基后蛋白肽链的相对分子质量约29000。重组安克洛被证明具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活力与天然安克洛相近。结论:采用毕赤酵母表达系统表达并获得有生物学活性的重组安克洛,为大规模生产打下了基础。

^(125)I-rAncrod在大鼠体内的组织分布与代谢

为研究125I-rAncrod(1.59μg·kg-1)在Wistar大鼠器官和组织分布以及粪尿和胆汁的代谢情况,采用放射性125I标记重组安克洛酶(125I-rAncrod)结合分子排阻色谱法(size exclusion chromatography,SEC)及γ-计数法测定不同时间组织及体液样品中125I-rAncrod的含量。结果显示,放射性药物浓度主要累积在甲状腺和胃肠道内,肝肾次之,而脑、脊髓、脂肪、肌肉中药物浓度一直处于较低的水平。Wistar大鼠尾静脉注射125I-rAncrod后,SEC色谱图显示到48h粪尿和胆汁中均检测不到原形药物。结果表明,大鼠尾静脉注射125I-rAncrod后在全身各器官和组织分布广泛,代谢较完全。