利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草

【目的】利用Cre/lox系统具有的特异重组特性,以绿色荧光蛋白GFP为目的基因,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【方法】将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与GFP基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草后获得抗除草剂Basta的GFP转基因植株。GFP转基因植株叶盘二次转化导入重组酶Cre基因后,实现与GFP基因连锁的Bar基因表达盒剔除,剔除Bar基因的植株开花后自交使重组酶Cre基因分离,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【结果】将含Bar基因表达盒以及GFP基因表达盒的植物表达载体转化烟草Wisconsin38后获得了抗除草剂Basta以及GFP荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入Cre基因,所获得的再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,绝大多数单株对应叶盘在含8mg·L-1PPT(phosphinothricin)的筛选培养基上无法再生死亡,删除效率在76%～100%。对Bar基因删除后区域片段进行克隆测序分析显示,Bar基因表达盒已经被精确删除。Bar基因删除植株开花后自交,获得的自交后代进行NPTⅡ抗性检测,NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有GFP基因。【结论】利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。

基于审计视野的地方国有独资公司重组定位研究——以W市为例

国有企业作为我国经济的"国家队",其作用与地位在国企改革进程中不停地演化。从20世纪的"国退民进"的"放权让利",到做强、做优、做大"国有资本",再到分类改革思想深化,国有企业肩负着新时代重大使命和责任。党的十九大报告中指出,要加快国有经济布局优化、结构调整、战略性重组,促进国有资产保值增值。因此,地方国有独资公司的重组与布局,关系到地方经济的平稳发展与国计民生的有效保障。本文基于审计视野对W市国企重组定位现状进行了调查分析,并从审计合规性、重组定位合理性出发对今后如何优化国资布局提出了相关建议。

SEB基因定位突变体构建及其重组表达产物生物学活性研究

目的 构建葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因及其突变体原核表达系统,了解突变前、后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化.方法 采用突变引物PCR构建SEB基因定位突变体,建立SEB基因及其定位突变体原核表达系统;同时采用Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的 重组蛋白;采用TCID50法测定目的 重组蛋白对Vero细胞的毒性;采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的 重组蛋白促使小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用.结果 所克隆的SEB基因核苷酸序列与各项研究报道的相似性为100%,3种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变.rSEB和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的40%;rSEB对Vero细胞TCIC50为3.4μg,其突变体重组蛋白分别为3.2～16.8μg;1和5μg/ml的rSEB及突变体重组蛋白rSEB/D9N对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用（P＜0.05）,10和20μg/ml的rSEB及rSEB/D9N促进小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml植物血凝素PHA相似（P＞0.05）.5～20μg/ml的rSEB及rSEB/D9N作用的小鼠脾细胞上清液及其上清液与脾细胞混合物均能有效抑制KB和HL-60细胞生长（P＜0.05）.结论 本研究成功构建了SEB基因突变体及其高效原核表达系统;其中突变体重组蛋白rSEB/D9N细胞毒性较低,促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强,可作为研制升高白细胞、抗肿瘤的SEB相关药物的候选突变体.

Cre重组酶结构与功能的研究进展

Cre loxP定位重组系统来源于噬菌体P1 ,由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下 ,设定的DNA片段可以被切除 ,可以发生倒位 ,亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单 ,Cre loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用 ,在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构。

Cre重组酶的研究进展

Cre重组酶来源于噬菌体P1基因组中的一段DNA序列编码的蛋白,是一种无需辅助因子即可进行位点特异性重组的生物酶。它的发现为基因靶位操作创造了有利条件,由于其作用方式高效简单,Cre定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用,文章就Cre重组酶的结构、功能、突变分析和改造及Cre重组酶的应用潜力等方面的研究进行了综述。

植物无标记转化的诱导表达Cre/loxP重组系统的构建

应用Cre/loxP系统位点专一性重组的特点构建诱导表达的定位重组系统,用以特异性的敲除转基因植物的标记基因。为了获得诱导表达启动子,从大豆基因组DNA中用pfu酶克隆热激蛋白启动子gmhsp17.5c,将其克隆到pUC118-HincⅡ载体并测序。结果表明,508nt的gmhsp17.5c与已报道序列(GenBank,AF544399)比较,核苷酸的同源性为99.8%。利用该诱导启动子分别构建了含gmhsp17.5c-cre基因组件和gmhsp17.5c-gus基因组的诱导型植物表达载体pC23HC和pC23HG。此外1个含有loxP-gus-loxP组件的组成型植物表达载体pC23LG被构建。通过对3个植物表达载体做多重酶切及亚克隆后测序分析表明载体pC23HC全长10947bp,载体pC23HG全长11396bp,载体pC23LG全长11900bp,符合预期设计。一套由pC23HC和pC23LG组成的植物无标记转化的诱导表达Cre/loxP重组系统被构建,为进一步将诱导表达的标记基因删除系统用于植物的无标记转化奠定基础。

Cre/lox定位重组系统共转化烟草及其精确重组

将噬菌体P1的Cre/lox定位重组系统的cre基因和含lox识别位点的两种结构通过土壤农杆菌介导的共转化方法导入烟草 ,得到双抗阳性苗 .经PCR检测表明 ,共转化苗中已包含上述两种结构 ,实验证明Cre/lox定位重组系统在共转化烟草中已进行Cre酶介导的DNA删除 .对重组后的有关DNA片段进行再克隆 ,序列分析表明 ,Cre/lox定位重组系统在烟草基因组中进行了精确的DNA重组反应 .

用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的:构建一个适用于大容量抗体库的噬菌体抗体表达载体。方法:通过插入人工合成寡核苷酸、PCR介导的定位突变等技术,将载体p3MH进行改造,使之更适于构建大容量抗体库。通过噬菌体抗体的表达、ELISA及细胞内重组试验鉴定所获得的表达载体。结果:通过插入loxp511和loxp序列,将Lac启动子更换为阿拉伯糖启动子、改造抗体基因克隆位点等,将p3MH改造成pAL。经检测pAL可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,其表达调控更为严密,可以在cre+细菌胞内发生预期的loxp-cre介导的定位重组。结论:所获得的表达载体pAL适用于构建大容量Fab噬菌体抗体库。

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre/loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pTTABn中的雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位点切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn。PCR方法从溶原菌BM25.8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI525CaMV35S-35S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。