家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16的表达规律及体外重组表达

家蚕(Bombyxmori)的丝腺是丝蛋白合成分泌的场所,存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。为探究家蚕丝蛋白的合成和保护机制,采用半定量RT-PCR的方法调查家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16在家蚕不同发育时期和5龄第5天幼虫各个组织器官中的表达特征,结果表明家蚕serpin16基因仅在4眠-5龄第6天的发育期表达,并且仅在丝腺中特异表达,其中在中部丝腺前区转录水平最高,而在中部丝腺中区和后区的转录水平较低;进一步构建pGEX-4T-1-serpin16原核表达载体,并转化至大肠杆菌(Eschevichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导获得融合蛋白,纯化后得到单一的目的蛋白。家蚕serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关,推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用。

2种家蚕蛋白酶抑制剂的重组表达及产物对胰岛素口服吸收的影响

口服胰岛素(INS)治疗糖尿病存在因胃肠道的蛋白酶而发生药物降解的问题。从家蚕蛹中分离了Bm Kazal、Bm CP82种蛋白酶抑制剂,设计其编码基因引物序列克隆2个目的基因,构建重组表达载体p ET28a-Bm Kazal和p ET32a-Bm CP8在大肠埃希菌(Escherichia coli)中表达并纯化了重组Bm Kazal和Bm CP8蛋白。将这2种蛋白酶抑制剂与INS混匀制成INS口服悬液给小鼠灌胃,研究其对INS口服吸收的影响。试验结果表明:按1.5 IU/kg剂量皮下注射INS的对照组小鼠,血药达峰浓度C_(max)为(7.56±1.40)m IU/L,达峰时间T_(max)为1 h;口服0.5μg/μL Bm CP8+15 IU/kg INS组、0.5μg/μL Bm Kazal+15 IU/kg INS组、0.5μg/μL Bm CP8+0.5μg/μL Bm Kazal+15 IU/kg INS组小鼠的血药达峰浓度C_(max)分别为(6.07±0.51)、(7.12±0.89)、(9.20±2.00)m IU/L,达峰时间T_(max)均为3 h;而按15 IU/kg剂量单纯口服INS对照组小鼠的血药浓度一直维持在4.32 m IU/L左右。以上结果说明Bm CP8、Bm Kazal能够协同INS经小鼠胃肠道口服吸收入血液,而且二者联合使用效果更好,使小鼠体内对INS的口服生物利用度由1.51%提高至4.17%,有促进小鼠对胰岛素口服吸收的作用。

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备

丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyxmoriserpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础。首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经IPTG诱导,获得原核表达重组融合蛋白,利用镍柱回收纯化技术,获得目的蛋白;经SDS-PAGE和抗His多抗检测,纯化蛋白的分子量大小与预测的一致,即获得了高纯度的目的蛋白,以此蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对昆明小鼠进行抗原免疫,最终获得抗serpin-4的多克隆抗体血清;该血清经ELISA和Westernblot验证,效价达到1:20000,特异性较好。家蚕serpin-4多克隆抗体的成功制备,一方面表明应用于其他生物的多克隆抗体制备所采用的方法对于家蚕serpin基因的研究同样适用;另一方面,也为深入研究家蚕serpin-4的生理功能打下了物质基础。

家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性分布

家蚕Bombyxmori的胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsininhibitor,CI)在家蚕发育过程中发挥着重要作用,具有丰富的多态性。为了进一步研究家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂在群体水平上的多态性分布,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,调查了425个家蚕品系的血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的分布情况。结果表明,基因IctA、IctD和IctE在所有家蚕品系中存在,暗示它们是家蚕正常生长发育必需的基因;相反,至少在9个家蚕品系中发现基因IctB和IctH都没有表达,而这些品系没有明显的生理缺陷。在中国品系和日本品系家蚕之间,胰凝乳蛋白酶抑制剂分布规律基本一致。对52个纯品系家蚕的胰凝乳蛋白酶抑制剂分布进行的聚类分析结果表明,胰凝乳蛋白酶抑制剂分布与其系统、眠性和化性都没有明显的相关性。所以家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂广泛存在于不同家蚕品系中,同时多态性的分布特征也表明其生理功能在进化过程中发生了明显的分化。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的促凋亡作用

为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝胶电泳法检测HL-60细胞的凋亡,用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL-60细胞后引起的凋亡现象。结果表明:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100μg/ml重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导细胞凋亡,这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据,也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Bmserpin-6的特异性表达分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)在昆虫的先天性免疫及生长发育中发挥重要作用。为研究家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6(Bmserpin-6)在家蚕表皮黑化反应、蜕皮变态和先天性免疫等生理过程中的功能作用,采用实时荧光定量PCR方法,检测Bm-serpin-6 mRNA在家蚕幼虫组织和蜕皮过程以及免疫刺激处理后的转录特征。结果表明:Bmserpin-6 mRNA在4龄幼虫的头部、表皮、中肠、丝腺和脂肪体中有转录,其中在表皮中高水平转录,但在眠中的转录水平下调;在5龄幼虫头部的转录水平随发育时间呈先升后降的趋势;脂多糖(LPS)刺激5龄第3天幼虫后,Bmserpin-6 mRNA在血液和脂肪体中的转录水平上升,其中在脂肪体中的转录水平自刺激后6 h达到最高值,在血液中的转录水平自刺激后9 h达到最高值。结果提示,Bmserpin-6可能与家蚕的表皮黑化反应及蜕皮有一定关系。

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI37的克隆、表达及微生物诱导分析

【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂理化性质的研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是存在于荞麦种子中的一种抗营养因子。本文经过原核表达及两步层析纯化得到高纯度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI。通过分析表明,重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的性质类似。rBTI的相对分子质量约为11kDa,等电点约为6.2。rBTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制摩尔比(以BApNA为底物)为1:1.5。rBTI的最适pH值为8.0,在pH3.0～8.0之间有较好的热稳定性,100℃加热120min仍保持70%的胰蛋白酶抑制活性。

家蚕Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因BmSPI3的克隆与表达特征分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)在机体的发育、免疫等生理过程中发挥重要的作用。从家蚕蛹cDNA文库中获得一条全长为728bp的基因序列,对该基因编码的氨基酸序列进行同源性比对,发现其蛋白具有保守的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域(CⅠ-X3-CⅡ-X8-CⅢ-X14-CⅣ-X6-CⅤ-X13-CⅥ),且P1活性位点为赖氨酸(K),因此将该基因命名为BmSPI3(Gen-Bank登录号:DN237641)。通过PCR扩增BmSPI3基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-BmSPI3,并转化到E.coliBL21(DE3)表达,经SDS-PAGE电泳检测在约36kD处有明显的蛋白表达条带。提取各发育时期蚕体和5龄幼虫各个组织的总RNA进行荧光定量PCR,检测结果表明:BmSPI3在5龄幼虫期表达量最高,卵期最低;在5龄幼虫表皮中的表达量最高,在马氏管的表达量最低。推测BmSPI3对胰蛋白酶和类胰蛋白酶具有抑制作用。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响

先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的rBTI体外作用于人肝癌细胞HepG2后,采用MTT比色法检测抑制剂对HepG2细胞的抑制率,用DNA凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测HepG2细胞的凋亡.结果表明,rBTI在体外能够明显抑制HepG2细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA水平有关.通过RT-PCR检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平下调,促凋亡基因Bax mRNA有所上调,而对照GAPDH无变化.对HepG2细胞中Fas/Fas配体及半胱氨酸天冬酶(caspase)的研究证明,细胞经过rBTI处理后,对死亡受体Fas mRNA没有影响;rBTI可明显激活caspase-3和caspase-9酶活性,对caspase-8活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI对HepG2细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及Fas/Fas配体途径.

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a在大肠杆菌中的表达和纯化

为了大量制备重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa) ,对构建的基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa进行了表达条件的优化 .用摇瓶培养 ,rETIa蛋白占菌体总蛋白 4 0 %以上 .经破碎菌体 洗涤包涵体 溶解包涵体 复性初步纯化后 ,再经二步柱层析纯化获得电泳纯的rETIa蛋白 .测定了rETIa对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织型纤溶酶原激活因子缺失突变体 (NTA)的抑制活性 .

重组牛胰蛋白酶抑制剂对小鼠急性肝损伤的保护作用

目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对小鼠急性肝损伤的保护作用。方法小鼠60只随机分成6组:正常对照组、模型组、rBPTI的3个剂量组(分别为3、6、12×104kIU·kg-1)、抑肽酶组(6×104kIU·kg-1)。每天腹腔注射给药,7d后体外注射CCl4建立小鼠急性肝损伤模型。末次给药后眼眶取血测定小鼠血清ALT、AST活性,观察肝脏组织病理改变。结果各剂量rBPTI可不同程度降低小鼠血清ALT、AST活性,降低肝组织MDA含量,与模型组比较差异有统计学意义(P<0·05、P<0·01),同时不同程度减轻肝组织病理损伤。结论rBPTI对体外CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用,作用效果同天然BPTI相当。

家蚕不同品种与个体的血液胰凝乳蛋白酶抑制剂差异研究

胰凝乳蛋白酶抑制剂 (Chymotrypsininhibitor,CI)是家蚕血液中主要的蛋白酶抑制因子 ,为其正常生长发育所不可缺少 ,研究CI对阐明家蚕正常生理以及害虫防治等都具有重要意义。采用pH 8 3、4 0聚丙烯酰胺凝胶电泳和CI活性染色法 ,对 6个家蚕品种血液中的蛋白质含量和CI活性进行了测定 ,并对各品种CI活性的个体差异性进行了分析。结果表明 :结合pH 8 3和pH 4 0的电泳条件 ,可检测出Ict D ,Ict E ,Ict A ,Ict B ,Ict H基因所支配的 15种CI;6个品种中有 3个具有CI个体差异性 ,而且Ict E和Ict B在有的品种或个体无活性 。

蛇毒金属蛋白酶抑制剂重组蛋白抗肿瘤血管生成作用及其机制

目的研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂重组蛋白(recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor,r SVMPI)对血管生成的影响及其分子机制。方法应用鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管生成模型观察SVMPI重组蛋白对血管生成的影响;采用Alamar Blue分析方法检测人脐静脉内皮细胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)增殖能力、Annexin V-FITC双标记流式细胞术检测细胞凋亡、划痕标记法检测细胞体外迁移能力、Boyden小室分析方法检测细胞体外趋化能力及管腔形成法检测体外血管新生能力;通过real-time PCR及Western blot检测重组蛋白处理后的HUVECs KDR、FGFR-1表达。结果r SVMPI减少鸡胚尿囊膜新生血管密度指数,减弱由VEGF诱导的HUVECs趋化能力,抑制HUVECs体外新生小管的形成,降低HUVECs细胞KDR和FGFR-1的表达水平。结论r SVMPI可能通过阻断VEGF-KDR或b FGF-FGFR信号转导途径,发挥抑制血管生成的作用。

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin 6的原核表达及对酚氧化酶原活性和抗菌肽表达的调控作用

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)对昆虫的免疫反应起重要调节作用。根据家蚕基因组数据库序列设计引物,从家蚕幼虫血细胞中克隆了Bmserpin6的编码基因,并构建重组表达载体,在大肠杆菌中成功表达了重组Bmserpin6蛋白。将纯化的重组Bmserpin6注射家蚕5龄幼虫后6 h提取家蚕血液制备血清,检测血清样品中的酚氧化酶原活性显著下降(P<0.05)。体腔注射重组Bmserpin6后的家蚕5龄幼虫再通过微球菌诱导蚕体内抗菌肽gloverin2基因的表达,结果显示幼虫脂肪体和血细胞中的gloverin2基因表达显著下调(P<0.05)。依据上述结果推测:体外表达的重组Bmserpin6可以调节蚕体内2个重要的免疫途径,即抑制蚕体酚氧化酶原的激活和外源细菌诱导的蚕体抗菌肽的产生。

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6在不同发育时期的表达分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)是一类具有重要生理调控功能的蛋白酶超家族。为研究家蚕serpin-6基因(Bmserpin-6)在蚕体内的功能,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因mRNA在家蚕不同发育时期的转录水平。Bmserpin-6基因在家蚕各个发育阶段均有表达,在4龄眠期、5龄6d、吐丝48h(化蛹前)和化蛹6d的转录水平较高,在5龄4d、吐丝初期和蛹末期的转录水平较低。Bmserpin-6基因在5龄期家蚕精巢和卵巢中的表达均呈现先下降后上升的趋势。研究结果表明,Bmserpin-6基因mRNA的转录具有明显的时空特异性,推测其在家蚕不同的变态发育期执行不同的功能。

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a的制备及其在tPA突变体纯化中的应用

将基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa高密度发酵 ,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a (rETIa)蛋白在E .coli中得到较高水平表达 ,表达量占菌体总蛋白的 4 0 %以上 .经菌体破碎、包涵体变性、复性 ,二步柱层析纯化得到电泳纯的rETIa蛋白 .测得rETIa对t PA突变体(NTA)的抑制平衡常数Ki 为 8 72× 10 -8mol/L .据此利用纯化的rETIa蛋白制备rETIa Sepharose 4B亲和层析柱 .直接一步纯化NTA复性液 ,纯化的NTA纯度达 90 %以上 ,收率为 96 2 % ,纯化倍数为 13 2 ,比活为(5 6 5 7± 71 3)U/μg .

重组牛胰蛋白酶抑制剂对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的保护作用

目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对大鼠慢性肝损伤的保护作用。方法大鼠98只,随机分成7组,分别为正常对照组、模型组、rBPTI3个剂量组(20,40和80MU.kg-1)、抑肽酶组(80MU.kg-1)和促肝细胞生长素组(100mg.kg-1)。除正常对照组外,其余各组皮下注射四氯化碳制备慢性肝损伤模型。8周后每天ip给药,给药4周后测定血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性、白蛋白(Alb)含量、白蛋白/球蛋白(A/G)比值、唾液酸(SA)含量及肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量,并进行组织病理学检测。结果与正常对照组比较,模型组大鼠血清GPT和GOT活性、SA含量及肝组织Hyp含量明显升高,血清Alb含量和A/G比值明显降低。与模型组比较,rBPTI各剂量组大鼠血清GPT和GOT活性、SA含量及肝组织Hyp含量降低,血清Alb含量和A/G比值明显增高。肝组织病理观察显示,rBPTI明显减轻由四氯化碳所致肝细胞脂肪变性及纤维组织增生等病理改变。结论rBPTI对四氯化碳诱导的大鼠慢性肝损伤具有保护作用和抗纤维化作用,在所观察的剂量范围内作用效果与抑肽酶相当。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂延长C.elegans寿命的作用机制

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI）是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,r BTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对r BTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的r BTI突变体,分别命名为r BTI-R45A,r BTI-R45F,r BTI-W53R和r BTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型r BTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0-10μmol/L范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10μmol/L野生型r BTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体r BTI-R45 A,r BTI-R45 F和r BTI-W53 R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型r BTI可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种r BTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,r BTI可增强长寿因子DAF-16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发r BTI的功能提供了实验支持和理论基础。

重组丝氨酸蛋白酶抑制剂对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠的影响

目的探讨重组丝氨酸蛋白酶抑制剂(Vaspin)对链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病大鼠的影响。方法通过体外表达获得重组Vaspin蛋白。采用高脂饲料加小剂量注射STZ诱导2型糖尿病SD大鼠模型,对照组大鼠给予普通饲料喂养。将造模成功的大鼠随机分成两组,实验组腹腔注射100μl 0.5 mg/ml重组Vaspin蛋白,模型组以生理盐水代替,每天给药1次,连续给药2 w后,进行口服吐葡萄糖耐量(OGTT)试验;分离血清,测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)以及肿瘤坏死因子(TNF)-α,瘦素(Lep)的水平。结果 OGTT结果显示经过重组Vaspin蛋白腹腔注射治疗后的糖尿病大鼠血糖变化曲线接近于正常,且2 h后下降至对照组大鼠水平。经过Vaspin蛋白治疗2 w后,实验组大鼠的TC、TG、LDL和FBG、FINS、胰岛素抵抗(IR)均显著降低,脂肪因子Lep和TNF-α下降至正常水平。结论该研究获得的重组Vaspin具有活性,可以降低糖尿病大鼠的血糖,改善糖尿病大鼠的糖脂代谢和IR水平。