GnRH-PE Ⅱ-luffinS重组嵌合毒素的制备与细胞毒性检测

目的:制备以Ⅰ型促性腺激素释放激素(GnRH Ⅰ)为导向部分,以绿脓杆菌外毒素的结构域Ⅱ(PEⅡ)为转膜区,以丝瓜毒素luffinS2为毒性部分的重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS,体外实验检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:重叠PCR法扩增GnRH-PEⅡ-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶(rEK)切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa,A549,HepG-2,SP2/0和鸡胚成纤维细胞(CEF)的体外细胞毒作用。结果:成功构建了GnRH-PEⅡ-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为94%。GnRH-PEⅡ-luffinS对HeLa,A549,HepG-2和SP2/0的IC50分别为13.50μg/ml,13.74μg/ml,16.79μg/ml和26.07μg/ml,而对CEF无作用。结论:重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS对肿瘤细胞有较强的杀伤作用。

小分子GnRH-luffinS重组嵌合毒素的制备及其细胞毒性检测

目的:制备以小分子丝瓜素(luffin)S2为毒性部分,以Ⅰ型促性腺激素释放激素(GnRH)为导向部分的重组嵌合毒素GnRH-luffinS,体外检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:重叠PCR方法扩增GnRH-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶(rEK)切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa,A549,HepG-2,SP2/0和鸡胚成纤维细胞(CEF)的体外细胞毒性。结果:成功构建了GnRH-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为93%。GnRH-luffinS对HeLa,A549,HepG-2和SP2/0的IC50分别为67.19,70.42,84.44和106.25μg/ml,而对CEF无作用。结论:重组毒素GnRH-luffinS对肿瘤细胞有一定的杀伤作用。

重组嵌合毒素研究近况

重组嵌合毒素是现代抗肿瘤药物研究的一个令人瞩目的领域.由于化疗药物对人体危害较大和不敏感性等,使毒素在肿瘤治疗方面的作用日益受到重视,利用基因融合的方法制备重组嵌合毒素,使新生的蛋白物质既有毒素的细胞毒作用又有特异结合功能,在体内、体外都显示出良好的杀伤靶细胞作用.

重组白喉毒素-人白细胞介素13嵌合毒素诱导胶质瘤细胞凋亡作用的初步研究

目的 探讨重组白喉毒素-人白细胞介素13嵌合毒素DT389-IL13对胶质瘤细胞的杀伤作用机制。方法 在U251细胞中加入不同浓度的嵌合毒素DT389-IL13,作用72 h后分别进行H33342染色,观察胶质瘤细胞核形态,电镜观察细胞超微结构,用流式细胞仪计数亚二倍体细胞百分数等。结果 3种检测结果均表明,嵌合毒素DT389-IL13可诱导U251胶质瘤细胞发生凋亡,1×10-9mol/L嵌合毒素作用72 h后亚二倍体细胞百分比为38％,1×10-8mol/L.作用后亚二倍体细胞百分比为99％,明显高于对照组(3.63％),与荧光染色观察的结果一致;电镜下还可见固缩的线粒体。结论 嵌合毒素DT389-IL13可诱导胶质瘤细胞凋亡。