重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

以毕赤酵母为表达系统,建立生产重组巴曲酶的技术工艺路线。通过递归式PCR的方法,人工合成了巴曲酶基因,将其插入pPIC9表达质粒中,转化至毕赤酵母GS115(his4),筛选出的表达株经甲醇诱导,表达了重组巴曲酶,并得以纯化。从每升发酵液中可纯化得到10mg重组巴曲酶,其比活为238NIHunits/mg,分子量为30.55kD。重组巴曲酶在体外可使纤维蛋白凝固,在体内缩短小鼠出血时间。为开发重组的蛇毒类凝血酶止血剂打下了基础。

重组巴曲酶(rBAT)止血作用实验观察

目的:研究重组巴曲酶(rBAT)对正常大、小鼠及尿激酶致模小鼠的止血作用。方法:用断尾法测出血时间(BT),玻片法测凝血时间(CT)。主要观察rBAT对正常大、小鼠BT和CT的影响和对正常小鼠止血作用的时效关系。同时观察rBAT对尿激酶所致的小鼠出血倾向模型的治疗作用。结果:rBAT0.5～3.3KU·kg^(-1)可使正常小鼠BT和CT显著缩短,但剂量加大至10.0KU·kg^(-1)时又使BT和CT延长。0.25～5.00KU·kg^(-1)可显著缩短正常大鼠的BT和CT,剂量加大至10.0KU·kg^(-1)时使BT略有延长。其对正常小鼠的止血作用可持续2h以上。rBAT对于尿激酶所致的小鼠出血倾向具有一定的逆转作用。结论:rBAT低剂量时具有显著的止血作用。

重组巴曲酶对猴长期毒性观察

目的:观察重组巴曲酶(rBAT)连续iv30 d对猴的长期毒性。方法:健康恒河猴按体质量随机分为低、中、高剂量组(1.5、5.0和15.0 kU/kg)和溶剂对照组(n=6,雌雄各半)。连续30 d静注给药。末次给药后处死一半动物做病理解剖,另一半停药后继续观察15 d。观察症状和检测指标包括:(1)一般症状;(2)心电图;(3)凝血时间(CT)等血液学指标;(4)血浆纤维蛋白原含量(Fib)等血液生化指标;(5)尿液检查;(6)骨髓检查;(7)病理检查;(8)抗体检测。结果:d15及d30给药后30 min采集的血样中,与d0或与溶剂对照组相比,低、中、高剂量组的Fib明显减少,且有剂量依赖性,但d15及d30给药后24h及d45采集的血样中上述指标恢复正常。病理组织学检查发现d30及d45各剂量组均有部分动物肝肾淤血,细胞轻度水肿,可能是动物隐性感染;d30注射部位皮肤出现局部炎症反应,d45炎症反应基本消失。其余观察指标未见明显异常。d15到d45均可检测到抗rBAT非中和抗体。结论:rBAT对猴血液系统有一定的药理毒理作用,主要表现为使猴低、中、高剂量组Fib呈剂量依赖性降低。rBAT对猴药理毒理作用靶器官为血液系统,其作用均是可逆的。rBAT对猴的安全剂量为1.5 kU/kg。临床使用时应密切注意rBAT对血液系统的影响。

重组巴曲酶作用机制的初步研究

目的研究重组巴曲酶(rBAT)对凝血系统的作用机制。方法通过研究rBAT对实验动物的凝血4项:凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、部分凝血活酶时间(APTT)纤维蛋白原(Fig)含量的影响;rBAT对血小板功能的影响;以及rBAT对纤维蛋白原的作用,来考察rBAT对凝血系统的作用机制。结果rBAT对实验动物的PT、TT、APTT和血小板功能无显著影响,但是能降低血中Fig的含量,并能释放Fig分子中的纤维蛋白肽A(FpA),促进Fig分子发生不完全的聚合反应,同时rBAT能缓慢的降解Fig的α肽链。结论rBAT的作用机制在于能够释放Fig分子的FpA,使Fig聚合成为不完全的纤维蛋白单体和纤维蛋白聚合物。

重组巴曲酶对凝血系统的双向作用

目的 研究重组巴曲酶（rBAT）对动物凝血系统的作用。方法 通过测定实验动物的出血时间（BT）、凝血时间（CT）和血栓干、湿重，观察rBAT对正常小鼠BT，CT的影响和对正常小鼠止血作用的时效关系；rBAT对肝素和尿激酶所致的小鼠出血倾向模型的治疗作用；以及rBAT对正常大鼠体内结扎静脉血栓形成的影响。结果rBAT0．5—3．3KU·kg^-1可使正常小鼠BT，CT显著缩短，但剂量加大至10．0Ku·kg^-1时又使BT，CT延长；其对正常小鼠的止血作用可持续2h以上；rBAT对于肝素和尿激酶所致的小鼠出血倾向具有一定的逆转作用；rBAT3．0—10．0KU·kg^-1可促进大鼠体内血栓形成，30．0KU·kg^-1则起抑制作用。结论 rBAT对实验动物的凝血系统具有双向作用。

重组巴曲酶在猕猴体内的药动学

目的：研究重组巴曲酶（rBAT）在猕猴体内的药动学。方法：用Iodogen法制备^125I-rBAT，然后采用交叉试验设计，分别给猕猴静脉注射不同剂量和肌内注射^125I-rBAT，用酸沉淀法测定血清^125I-rBAT浓度，计算药动学参数。结果：猕猴单次静脉注射0．1，0．4和1．6ug·kg^-1的^125I-rBAT后，末端半衰期t1/2分别为（1．9±0．8），（2．5±0．5）和（2．3±0．4）h，AUC0-12h分别为（4．1±1．4），（17．3±3．8）和（63．3±16．6）ng·h·mL^-1。肌内注射0．4ug·kg^-2的^125I-rBAT后，AUC0-12h为（3．6±0．4）ng·h·mL^-1，t1／2为（3．2±0．9）h，Tmax为（3．3±0．6）h，Cmax为（0．7±0．1）ng·mL^-1，肌内注射的AUC0-12h显著低于同剂量静脉注射的AUC0～12h，肌内注射的生物利用度为（20．8±2．3）％。结论：重组巴曲酶在猕猴体内的药动学过程符合线性药动学。

重组巴曲酶对大鼠长期毒性观察

目的研究重组巴曲酶(rBAT)连续静脉注射30d对大鼠的长期毒性。方法健康SD大鼠按体重随机分为低、中、高剂量组(3.0、10.0、30.0KU·kg-1)和溶媒对照组(n=20)。连续30d尾静脉注射给药。末次给药后处死一半动物做病理解剖,另一半停药后继续观察15d。观察症状和检测指标包括:一般症状;血液学指标;血液生化指标;凝血指标;非特异性免疫学检查;抗体检测;病理检查等。结果rBAT可能对大鼠的CT有一定的影响,且不同剂量对CT的作用不同;rBAT能显著降低大鼠血浆Fig含量,且呈剂量依赖性。30d雄性大鼠血清ALT呈剂量依赖性的升高。以上作用均是可逆的。结论rBAT对大鼠凝血系统及肝功能有一定的可逆的毒性作用。大鼠静脉注射rBAT的安全剂量为3KU·kg-1。

地高辛标记探针检测重组定点突变巴曲酶蛋白宿主DNA残留量的研究

目的建立检测重组定点突变巴曲酶原液中外源性DNA残留量的方法。方法从重组定点突变巴曲酶酵母工程菌提取基因组DNA作为模板,制备地高辛标记探针。此探针与样品进行点样杂交,并进行显色反应。结果 3批重组定点突变巴曲酶原液中,每人份剂量的宿主DNA残留量均<10ng。结论该方法检测灵敏度较好,特异性较强,可用于重组定点突变巴曲酶的检测。

重组定点突变巴曲酶质量标准研究

目的建立重组定点突变巴曲酶的质控方法和质量标准。方法生物学活性测定采用血浆凝集活性测定法;通过胰蛋白酶消化和RP-HPLC法分析该蛋白还原型肽图;其余检测项目均按《中华人民共和国药典》2010年版(三部)相关规定进行。结果用建立的方法对三批重组定点突变巴曲酶原液和成品进行检定,各项指标均符合2010版《中华人民共和国药典》和相应指导原则的要求。三批原液比活性均≥2000kU/mg。肽图三批次之间一致,原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、N末端氨基酸序列等指标均符合规定。结论建立的质控方法可有效地控制重组定点突变巴曲酶产品质量,并可用于定点突变巴曲酶原液及成品的常规检定。

重组定点突变巴曲酶酶学性质研究

目的对重组定点突变巴曲酶的酶学性质进行研究，为开发成临床用药奠定基础。方法测定不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响。结果重组定点突变巴曲酶的最适pH值在6．5～7．5之间。该酶在50℃以下活力保持90％以上，但当温度超过60℃时，该酶已完全失活。Ca^2＋和Na^＋离子对酶的稳定性无明显影响，而Mg^2＋、K^＋、Mn^2＋离子则表现为激活作用，Zn^2、＋Cu^2＋、Fe^2＋、Co^＋离子则表现为明显的抑制作用。结论重组定点突变巴曲酶在中性条件下比较稳定，它不耐高温，金属离子对其活性有一定的影响。

巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

目的研究巴曲酶在毕赤酵母菌中的表达。方法按Pichia pastoris偏好密码子人工合成巴曲酶全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入X-33,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的巴曲酶。经SDS-PAGE电泳确定其分子量为33.0kDa,免疫印迹证明重组巴曲酶具有天然巴曲酶的免疫活性。结果经发酵条件的优化,发酵罐的表达量达到25000Ku/L发酵液,从每升发酵液中可纯化出11.0mg重组巴曲酶。结论巴曲酶毕氏酵母菌成功的构建,为重组巴曲酶止血药的开发奠定了基础。

毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究

目的对表达重组巴曲酶的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化，确定最佳的发酵控制条件以获得重组巴曲酶的最高表达量。方法通过多因素正交实验确定巴曲酶发酵培养的最适培养条件。结果表达温度在25℃，pH值为7．0，加入甲醇的量为10g／L时为最优发酵条件，诱导表达时间为84-96h。结论重组巴曲酶可以开发为止血药，代替临床应用的从蛇毒中提取的巴曲酶。

重组巴曲霉的ELISA阻断抑制检测法

目的制备多克隆羊抗巴曲霉(BAT)血清,建立检测巴曲霉的ELISA定量测定方法。方法用重组巴曲酶(rBAT)免疫山羊制备抗血清,建立测定巴曲霉的ELISA方法,并对其灵敏度、精密度、特异性与回收率进行评价。结果制备的山羊多克隆抗rBAT血清效价两只均可达到1∶105(间接ELISA法)。优化后的ELISA法对rBAT的测定灵敏度可达25.6pg/ml,在25.6～80000pg/ml浓度范围内呈现良好的线性关系,一次回归方程(Y=1.28409-0.21362X)相关系数(r)>0.990。应用该法对系列标准样品浓度的rBAT进行重复测定,结果其批内平均变异系数(CV)为(5.2±2.4)%(n=8),对含BAT的模拟血清样本测定其平均回收率为(99.5±3.6)%,特异阻断抑制试验最高抑制率达80.4%。结论本法灵敏度高,重复性好,并具有较好的实验结果特异性,可作为血清样本BAT浓度测定的一种推荐方法。