重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究

目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显著(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位鼻腔免疫凝胶剂的研制

目的研制重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗凝胶剂,考察其特性及免疫效果。方法以卡泊波为基质,脱氧胆酸钠为黏膜吸收促进剂,制备凝胶剂,以落球法测定凝胶的黏度,SDS-PAGE电泳分析脱氧胆酸钠对蛋白纯度的影响,以免疫印记检测疫苗蛋白的完整性,以留样观察法及离心法考察凝胶的稳定性,以含抗原凝胶剂鼻腔免疫BALB/c小鼠,并与溶液剂相比较,考察凝胶剂的免疫效果。结果制备的凝胶剂稳定性好,凝胶的黏度为8050mPa.s,脱氧胆酸钠不影响蛋白的纯度,抗原蛋白的完整性良好。小鼠鼻腔免疫凝胶剂后产生了较强的特异性血清IgG及胃肠sIgA反应,优于液体免疫。结论重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位凝胶剂性质稳定,具有生物黏附性,可提高免疫效果,是较好的鼻腔免疫剂型。

BalB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫应答

目的 评价重组尿素酶B亚单位 (rUreB)作为幽门螺杆菌 (Hp)口服疫苗成份的效果、探讨Hp的免疫保护机制。方法 采用重组Hp保护性抗原UreB与粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位 (CTB)共口服免疫BalB/c小鼠 ,ELISA分析血清、唾液和粪便、胃粘液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL 4、IFN γ的变化。结果 BalB/c小鼠口服rUreB和CTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。

金属螯合亲和层析法对重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的纯化

背景:幽门螺杆菌（H.pylori）疫苗是近年研究的热点。H.pylori尿素酶B亚单位（UreB）是理想的候选抗原。目的:获得纯化的重组H.pylori UreB（rUreB）,为进一步的H.pylori疫苗制备打下基础。方法:采用金属螯合亲和层析法（MCAC）在变性条件下纯化rUreB,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和免疫印迹法鉴定纯化产物的分子量、纯度和抗原性。结果:纯化产物的分子量与预计分子量相符,具有良好的特异性UreB免疫原性,且一步即可达到90％以上的纯度。结论:MCAC是一种简单、高效的rUreB纯化方法。

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位

目的 建立一种有效的方法，从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（rUreB）。方法重组大肠杆菌发酵后，表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性，采用Q Sepharose Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化。使用 SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用 ELISA和 Western－bloning对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后，rUreB的纯度＞70％。包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95％。rUreB纯品具有良好的生物学活性。结论 建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺，为进一步的研究打下了基础。

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因,并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果重组UreB在大肠杆菌中表达,相对分子质量约62 000,表达率26%,N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP,肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB/c小鼠,能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示,重组UreB具有良好的免疫原性和反应性,表现出与天然Hp UreB相似的生物学功能。结论为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。

携带幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建

目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(ureB)基因重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA扩增ureB基因,克隆入pUCmT载体,检测ureB基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定。重组载体pIRES ureB转入减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,再次转入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES ureB转染COS 7细胞,SDS PAGE Western 印迹法检测pIRES ureB表达蛋白的免疫原性。结果 扩增出长约1700 bp的ureB基因,测序结果表明扩增出的ureB基因与基因库Hp ureB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实ureB基因克隆入真核表达载体pIRES,并成功构建了Hp ureB基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,并且Western印迹法检测到特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的Hp UreB减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其体内的免疫作用奠定了基础。

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质研究

目的 分析重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质。方法 重组尿素酶B亚单位注射免疫BALB/c小鼠、家兔 ,双向琼脂扩散、ELISA、免疫印迹分析特异抗体的产生及性质。结果 重组尿素酶B亚单位能有效刺激机体的免疫应答 ,且产生的抗体能与天然幽门螺杆菌发生抗原抗体反应。结论 重组尿素酶B亚单位表现出天然幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质 。

大肠杆菌表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份

目的重组表达人幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位跨膜区成份。方法采用 DNA重组技术将尿素酶 B亚单位 3'端732 bp基因片段克隆至 p ET11C载体上 ,转化宿主菌 BL 2 1(DE3) E.coli,IPTG诱导 ,SDS- PAGE及 Western- blot分析表达情况。结果成功构建了含 Ure B0 .7kb片段的重组质粒 p ET- Ure B0 .7,并表达了具有免疫反应性的分子量约 2 80 0 0 u的重组蛋白 ,表达率为 19.8%。结论重组的尿素酶 B亚单位跨膜区成份为研究其相关生物学特性奠定了重要基础 ,亦可作为 Hp疫苗的成分用于

中国人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的基因克隆及序列分析

目的克隆人幽门螺杆菌 (helicobacter pylori,Hp)尿素酶 B基因 (ure B) ,并分析其核苷酸序列的特性。方法用PCR技术从临床分离的 Hp菌株基因组中扩增出 ure B基因 ,将其克隆至 p HP质粒上进行序列分析。结果克隆得到的 ure B基因长度为 1713bp,其核苷酸序列与 Gen Bank公布的序列有 6 1个碱基存在差异 ,同源为 96 .44 % ,推定的氨基酸序列同源性为99.6 5 %。结论我们所克隆的 ure B基因可用于 Hp保护性抗原 Ure

过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防小鼠幽门螺杆菌感染

目的利用人类幽门螺杆菌(H.pylori)感染的小鼠模型研究过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防H.pylori感染的作用。方法把实验动物无特定致病菌C57BL/6小鼠分成7组,分别通过灌胃方法给予过氧化氢酶和尿素酶B亚单位(各100μg)加霍乱毒素(CT)(2μg)、过氧化氢酶(100μg)加CT(2μg)、尿素酶B亚单位(100μg)加CT(2μg)、PBS、单纯过氧化氢酶(100μg)、单纯尿素酶B亚单位(100μg)、单纯CT(2μg),共4次。2周后再用活H.pylori灌胃,再4周后处死动物,取胃粘膜行半定量细菌培养检查H.pylori情况。结果实验各组H.pylori完全保护率分别为:过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加CT组83.3%(20/24)、过氧化氢酶加CT组41.7%(10/24)、尿素酶B亚单位加CT组54.2%(13/24);生理盐水组、单纯过氧化氢酶、单纯尿素酶B亚单位、单纯CT组根除率均为0%。未完全保护的小鼠,疫苗组H.pylori的定植密度明显低于其它4组(P<0.05)。此外,二价疫苗组的H.pylori完全保护率及定植密度较单价疫苗组均有显著性差异(P<0.05)。结论由过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加免疫佐剂组成的二价口服疫苗较单价口服疫苗有更好的免疫预防效果。

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株的构建

目的采用平衡致死系统构建表达幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株。方法 PCR扩增幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位 ,与 p YA 3149(asd+ )载体质粒重组 ,转化减毒的伤寒沙门氏菌突变株 ,SDS- PAGE,用 western- blot分析其表达 ,并观察重组菌体外传代培养的稳定性。结果利用宿主 -载体平衡致死系统构建了表达幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位的重组减毒沙门氏菌工程菌株 ,且在有选择压力的条件下在体外能稳定地繁殖、生长和传代。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的疫苗研究进展

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种定植在人胃和十二指肠的微需氧、革兰氏阴性、螺旋弯曲菌。H.pylori是上消化道的主要致病菌,与胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）和胃癌等疾病的发生密切相关。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

目的 通过对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hipylori)尿素酶B亚单位在大肠杆菌中表达的研究,探索其免疫反应性。方法 用高保真PCR方法扩增H.pylori ureB基因,并定向克隆入pNEB193中,然后经酶切回收后插入原核表达载体pMAL-C2X进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果 特异PCR和酶切鉴定证实融合基因ureB克隆入表达载体,SDS-PAGE结果显示ureB在大肠杆菌中以融合蛋白形式MBP-ureB高效表达,约占细胞总蛋白量的26.7％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清发生特异反应。结论 成功构建了能高效表达H.pylori ureB的重组菌,为Hp基因工程疫苗的进一步研究奠定了基础。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析,为H.pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法获得国内分离H.pylori菌株MEL-HP27和国际标准参考株H.pylori的ureB基因,通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1.71 kb的ureB基因片段,特异PCR可扩增出ureB基因片段,证实H.pyloriureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序,国内分离H.pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp(Genbank收录号:AY295085),编码由569个氨基酸残基组成的肽链,ureB基因序列与GenBank公布的H.pylori相应基因同源性高达96.08％-98.30％,氨基酸序列同源性在98.77％-99.82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因,其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97.67％。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

通过不同培养基、不同葡萄糖浓度、不同溶氧条件、补料与非补料对幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)基因工程菌的菌体生长与外源蛋白表达量的影响的比较 ,建立了稳定、适宜的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因工程菌发酵工艺。多批实验结果证明 ,菌体单产可达 86 g/L ,目的蛋白的表达率为 38.2 %。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位融合肽在大肠杆菌中的表达与纯化

构建霍乱毒素B亚单位(CTB)与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位(Ure B)表位的融合肽表达载体pET-CtUBE,在E.coliBL21(DE3)中表达融合肽CtUBE。以霍乱弧菌基因组DNA为模板,PCR扩增CTB编码序列,克隆到表达载体pET-28a,获得新质粒pET-CTB;化学合成Ure B表位编码序列,克隆到pET-CTB获得CtUBE表达载体pET-CtUBE,并转化E.coliBL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导融合肽表达,阴离子交换色谱柱纯化融合肽CtUBE,ELISA分析CtUBE复性结果。结果获得了表达融合肽CtUBE的工程菌,诱导后融合肽表达量占菌体总蛋白34.7%,CtUBE纯化后纯度为95.6%,复性后融合肽可与GM1神经节苷脂和抗Ure B血清结合。实验成功构建了表达Ure B表位融合肽的工程菌,融合肽CtUBE保持了CTB生物活性和反应原性,纯度符合疫苗抗原要求,可以用于抗HP感染的疫苗研制。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位特异性抗体检测方法的建立与评价

目的建立并评价幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)特异性抗体的检测方法。方法应用纯化的重组HpUreB作为包被抗原,建立检测HpUreB特异性抗体的ELISA间接法。以Hp抗体Western blot检测作为“金标准”,评价所建立方法的真实性和可靠性。结果检测血清特异性IgG的灵敏度为100·0%,特异度为97·7%,阳性预测值为97·2%,阴性预测值为100·0%,约登指数为0·977,符合率为98·7%,试验的一致率为98·5%;检测血清中总的特异性Ig灵敏度为97·1%,特异度为95·3%,阳性预测值为94·4%,阴性预测值为97·6%,约登指数为0·925,符合率为96·2%,试验的一致率为97·8%;检测唾液中特异性sIgA的灵敏度为96·2%,特异度为94·5%,阳性预测值为89·3%,阴性预测值为98·1%,约登指数为0·907,符合率为95·1%,试验的一致率为97·5%;检测粪便标本中的特异性sIgA的灵敏度为92·0%,特异度为90·2%,阳性预测值为85·2%,阴性预测值为94·9%,约登指数为0·822,符合率为90·9%,试验的一致率为98·6%,CV值均小于15%。结论该检测方法真实性、可靠性、重复性良好,能满足临床标本检测的要求。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位W/O/W型复乳剂的研制

目的 制备重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB)复乳剂,研究其物理性质及免疫效率。方法 设计处方采用二步法制备复乳,显微镜观察乳滴结构及粒径分布,以电导法测定包封率,以经典法、离心法及电导法观察复乳的稳定性,免疫印迹观察抗原制备成复乳剂后免疫反应性的变化,以动物实验观察rUreB复乳的免疫效率。结果 制备的rUreB复乳性质稳定、包封率98.3％、粒径大小主要在2～10μm,免疫印迹及小鼠口服免疫后特异性抗体测定结果表明,该复乳具有良好的免疫原性,剂量小、免疫效率高。结论 将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位制备成复乳剂可得到高效、廉价、使用方便的疫苗,复乳是一个很有潜力的黏膜疫苗传送系统。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的分段表达及免疫学性质分析

目的分段表达幽门螺杆菌(HP)尿素酶B亚单位(UreB),并对其进行免疫学性质分析,为精确定位其保护性表位奠定基础。方法用生物信息学软件分析UreB全长基因,选择分段点,PCR分别扩增其5个片段,构建于pET-11c(+)原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白表达情况,ELISA及Western blot分别鉴定其免疫原性及抗原性。结果成功克隆了UreB的5个基因片段,基因测序结果与Genbank公布的序列一致.经SDS-PAGE分析,5个蛋白表达相对分子质量大小都与预期相符,在大肠杆菌中实现了表达。ELISA和Western blot分析显示,表达的5个蛋白表现出良好的抗原性和免疫原性。结论 UreB的分段表达为进一步研究UreB保护性表位及HP疫苗鉴定奠定了新的基础。