注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺的建立及效果验证

旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明,低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明,室温处理时间≥0.5 h,小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求,建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。

重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体在类风湿关节炎患者体内药动学研究

目的:研究连续静脉滴注重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体(anti-TNF rcMAb)在类风湿关节炎患者体内的药动学。方法:按GCP指导原则设计试验方案,选择9例类风湿关节炎患者,年龄(41±16)岁,在2h内匀速静脉滴注anti-TNF rcMAb,每次3mg·kg-1,共给药5次,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定人血清中各点anti-TNF rcMAb浓度。采用DAS2.1.1软件进行数据处理,计算药动学参数。结果:受试者多次静脉滴注anti-TNF rcMAb,按非房室模型计算,主要药动学参数t1/2为(9.2±1.8)d,Cssmax为(0.008±0.001)mg·L-1,Tssmax为(0.092±0.018)d,AUCss为(248±38)mg.d.L-1,Vss为(0.10±0.08)L·kg-1,DF为(5.5±0.6)。受试者在给药期间未出现严重不良反应。结论:本研究在给药后第3次时血药浓度可达到稳态,连续给药5次后体内未见蓄积,该方案适宜在临床推广使用。建议临床按此方案用药时,使用时间不宜过长,以减少药物不良反应。

重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体对类风湿关节炎患者的疗效及其Th细胞亚群的影响

目的研究重组抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）人鼠嵌合单克隆抗体（anti—TNF rcMAb）对类风湿关节炎（RA）患者治疗效果及对患者外周血Th1、Th17、调节性T细胞影响。方法50例经严格筛选的RA患者按随机分配原则分为2组。联合治疗组（40例），给予anti-TNF rcMAb（3mg／kg）＋甲氨蝶呤治疗；对照组（10例）单独接受甲氨蝶呤治疗，分别于0、2、6、14周给药，于0、18周分别观察联合治疗组与对照组的相关临床指标的变化，在相应观察点做ACR20、50、70评分。同时，对比外周血中Th1、Th17、调节性T细胞的表达情况及相关转录因子T-bet、维甲酸相关孤核受体（ROR）C、叉头状转录因子3（Foxp3）的mRNA表达水平变化。采用t检验和χ^2检验或Ridit作统计学分析。结果治疗前后，联合治疗组ACR20、50、70较对照组均有所改善，尤其ACR20改善程度与对照组相比，差异有统计学意义（Z=1．671，P=0．00094）。联合治疗组患者外周血Th17细胞无显著变化[（0周（1．1±0．6）％；18周（1．1±0．3）％]、Th1细胞比例降低[0周（7．1±3．9）％；18周（4．2±2．8）％]，调节性T细胞比例明显升高[0周（91．5±0．8）％；18周（3．0±0．6）％，t=2．301，P=0．048]；对照组Th1比例下降[0周（9．1±3．1）％；18周（5．8±2．6）％]，调节性T细胞比例略升高[0周（1．2±0．6％）；18周（2．2±0．6）％]。2组Th17、Th1细胞的转录因子RORC、T-bet mRNA表达水平降低，调节性T细胞转录因子Foxp3的表达水平均升高。结论anti-TNF rcMAb联合甲氨蝶呤治疗对RA患者疗效显著，可能通过影响患者外周血Th细胞亚群发挥其治疗作用。

抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体对阻塞性黄疸大鼠肝脏保护作用的实验研究

目的：探讨肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在阻塞性黄疸大鼠肝损伤中的作用及抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体（anti-TNF-αMcAb）的保护作用。方法：将雄性SD大鼠24只随机分为胆总管结扎组（BDL）、BDL＋anti-TNF-αMcAb组、假手术组（SO）。BDL＋anti-TNF-αMcAb组治疗于胆总管结扎后第3天开始经尾静脉注射anti-TNF-αMcAb（1mg／kg），连用5天；BDL组和SO组以同样的方法注射等量的生理盐水。分别检测各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和TNF-α水平，并在光镜和电镜下观察各组大鼠肝组织的病理变化。结果：BDL组及BDL＋anti-TNF-αMcAb治疗组大鼠血清ALT、AST和TNF-α水平均高于SO组（P〈0．01），但BDL＋anti-TNF-αMcAb治疗组增高的程度均低于BDL组（P〈0．05-P〈0．01），并且肝组织病理改变也较轻。SO组肝组织无明显病理改变。结论：TNF-α可能是阻塞性黄疸时肝损伤的重要介导因子，使用抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体，可以减轻阻塞性黄疸时肝损伤。

人源化抗人TNF-α单克隆抗体在转基因小鼠体内的药效学实验

目的研究人源化抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(recombinant humanization anti-human tumor necrosis factorαmonoclonal antibody,rhTNF-McAb)对人TNF-α转基因小鼠自发性关节炎的治疗作用。方法以市售药物Adalimumab为阳性药物,通过给予不同剂量的rhTNF-McAb对转基因小鼠的自发性足肿胀度、小鼠四肢综合肌力和踝关节组织病理学变化,用ELISA法检测小鼠体内人TNF-α质量浓度、血药质量浓度和抗药物抗体质量浓度。结果rhTNF-McAb(0.5 mg·kg^(-1),1.5 mg·kg^(-1),4.5 mg·kg^(-1))腹腔给药对人TNF-α转基因小鼠的自发性足肿胀有显著的治疗作用,并呈现明显的剂量依赖性关系,作用机制与阳性药物Adalimumab一致。但rhTNF-McAb在小鼠体内的清除情况,产生抗药物抗体的滴度与Adalimumab明显不同。结论rhTNF-McAb可以显著的抑制人TNF-α,并且其疗效更优于已上市类似药物Adalimumab。

单克隆抗体Infliximab治疗炎症性肠病的研究进展

Infliximab是一种嵌合型单克隆抗体,可靶向炎症性肠病(IBD)发病机制中起重要作用的促炎细胞因子-人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。Infliximab通过与巨噬细胞和T细胞表面的TNF-α结合而拮抗TNF-α的生物活性。Infliximab比大多数治疗IBD传统药物起效迅速,且药物不良反应较小。Infliximab可以有效治疗IBD,提高患者的生活质量。

重组抗肿瘤坏死因子-α全人源单克隆抗体在食蟹猴体内的药代动力学研究

目的研究抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)全人源单抗在食蟹猴体内的药代动力学特征及生物利用度。方法 20只食蟹猴皮下或静脉给予1,3或10mg·kg-1抗TNF-α全人源单抗,用ELISA试剂盒测定食蟹猴血浆中抗TNF-α全人源单抗的含量,研究其给药后168 h内药代动力学特征与生物利用度。结果抗TNF-α全人源单抗皮下注射给药的低中高3个剂量分别为1,3,10mg·kg-1时,AUC0-168随着剂量的增大而增大(P<0.05),而t1/2、Vz/F、Cl/F均不随剂量而改变(P>0.05)。比较中剂量的皮下与静脉2种给药方式,结果抗TNF-α全人源单抗皮下给药的生物利用度为77.5%。结论在本实验的给药浓度范围内,且在给药后168 h内,抗TNF-α全人源单抗在食蟹猴血浆中的暴露呈线性药代动力学特征,且皮下给药生物利用度较高,体内吸收良好。

TNF-α单克隆抗体对梗阻性黄疸大鼠肾脏保护作用的实验研究

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在梗阻性黄疸大鼠肾损伤中的作用及抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(anti-TNF-αMcAb)的保护作用。方法将雄性SD大鼠24只随机分为胆总管结扎组(BDL)、胆总管结扎+抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体治疗组(BDL+anti-TNF-αMcAb)、假手术组(SO)。BDL组和BDL+anti-TNF-αMcAb组均作胆总管结扎复制梗阻性黄疸模型,假手术组(SO)仅麻醉、开腹而不结扎胆总管。BDL+anti-TNF-αMcAb治疗组于胆总管结扎第3天开始经尾静脉注射anti-TNF-αMcAb(1mg/kg),连用5d;BDL组和SO组以同样的方法注射等量的生理盐水。分别检测各组大鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和TNF-α水平,并在光镜和电镜下观察各组大鼠肾组织的病理变化。结果 BDL组及BDL+anti-TNF-αMcAb组大鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和TNF-α水平高于假手术组(SO),P<0.05。但BDL+anti-TNF-αMcAb组增高的程度低于BDL组(P<0.05),并且肾组织病理改变也较轻。SO组肾组织无明显病理改变。结论 TNF-α可能是梗阻性黄疸时肾损伤的重要介导因子,使用抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体,可以减轻实验鼠梗阻性黄疸时的肾损伤。

Anti-TNF-αMcAb对创伤失血性休克大鼠肾脏保护作用的实验研究

目的 :研究肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(anti-TNF-αmonoclonal antibody,anti-TNF-αMc Ab)在创伤失血性休克大鼠肾脏损害中的作用。方法:24只成年雄性SD大鼠随机均分为Ⅰ组(对照组)、Ⅱ组(休克用乳酸林格氏液治疗组)和Ⅲ组(休克用anti-TNF-αMc Ab治疗组)。Ⅱ组、Ⅲ组用电刀在大鼠腹正中切开约5 cm长的切口,股动脉放血,制作创伤失血性休克动物模型;Ⅱ组用乳酸林格氏液治疗,Ⅲ组用含anti-TNF-αMc Ab(3 mg/kg)的乳酸林格氏液治疗,而Ⅰ组在相同条件下不进行创伤和失血。测定所有SD大鼠血清肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(urea nitrogen,UN)、TNF-α、肾组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平。在光镜、电镜下观察所有大鼠肾组织的病理学改变情况。结果 :Ⅱ、Ⅲ组大鼠血清Cr、UN、TNF-α、肾组织中MDA含量较Ⅰ组升高(P<0.05),SOD含量减低(P<0.05);Ⅲ组Cr(133.10±17.39)μmol/L、UN(23.78±5.49)mmol/L、TNF-α(106.85±14.65)pg/m L、肾组织中MDA(13.26±1.46)nmol/mgprot水平比Ⅱ组血清Cr、UN、TNF-α、肾组织中MDA水平降低(P<0.05),Ⅲ组SOD(79.26±11.21)U/mgprot水平比Ⅱ组增高(P<0.05)。Ⅲ组大鼠肾组织病理损伤比Ⅱ组轻。Ⅰ组无明显病理改变。结论:TNF-α可能是创伤失血性休克大鼠肾损害的重要介导因子,使用anti-TNF-αMc Ab治疗可以减轻创伤失血性休克时大鼠肾损害,为临床治疗提供新的策略。

重症急性胰腺炎肿瘤坏死因子-α与低钙血症的关系

目的 探讨重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型肿瘤坏死因子(TNF) α与血清钙水平的关系。方法 胰管内逆行注射5 %牛磺胆酸钠的方法建立SAP大鼠模型。将SD大鼠分为假手术组2 1只,SAP组2 1只,治疗组2 1只。治疗组为模型制作前15min自阴茎背静脉注入抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体(TNF αMcAb ,5mg/kg体重) ,观察血中TNF α与血钙的水平。酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞因子水平。结果 重症急性胰腺炎TNF α水平与血钙之间呈显著负相关(r =-0 .69,P <0 .0 1) ,在发病初期两者关系更紧密(6h组:r =-0 .73 ,P <0 .0 1)。TNF αMcAb能改善胰腺病理变化、降低淀粉酶、降低血清TNF α、升高血钙,6hSAP组血清钙(1.99±0 .0 3 )mmol/L ,TNF αMcAb治疗组血清钙(2 .0 6±0 .0 6)mmol/L ,P <0 .0 5 ;12hSAP组血清钙(1.88±0 .0 5 )mmol/L ,TNF αMcAb治疗组血清钙(1.94±0 .0 5 )mmol/L(P <0 .0 5 )。结论 TNF α可能在SAP并发低钙血症的机制中发挥作用。

应用骨髓法培养树突状细胞的研究

目的探讨培养树突状细胞(DC)的最佳方法和合理的培养时间。方法取大鼠的骨髓细胞分别加入4种细胞因子重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGMCSF)5μg/L,重组大鼠白细胞介素4(rrIL4)5μg/L,重组大鼠肿瘤坏死因子α(rrTNFα)10μg/L,重组大鼠γ干扰素(rrγIFN)20μg/L培养2周,并用PE标记的抗大鼠CD86单克隆抗体检测它的成熟度。结果从第7天开始细胞周围开始逐渐伸出突起,第13天以后突起5～6支左右,且长度逐渐缩短,成熟的树突状细胞伸出长短不等的突起,类似神经细胞的树突。60只大鼠培养所得的树突状细胞平均为(1.18±0.21)×107第7、11、13、15天的CD86单抗的阳性率分别为30%、80%、92%、94%,随着时间的延长,它的阳性率不断增加,尤以第1周到第2周之间增长的特别明显,但2周以后,树突状细胞的成熟度无明显提高。结论应用骨髓法来培养树突状细胞加入细胞因子rrGMCSF、rrIL-4、rrTNF-α、rr-γ-IFN培养2周,可得到成熟的树突状细胞。