新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)内毒素检查方法比较

目的为新型冠状病毒(简称新冠病毒)灭活疫苗(Vero细胞)的细菌内毒素检查和质量控制提供技术支持和理论基础。方法利用凝胶法、光度测定法[包括动态浊度(TKA)法、微量动态显色(mKCA)法]测定并比较新冠病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液和成品中内毒素浓度。结果3种方法测得的供试品内毒素浓度均符合规定(原液为不超过5 EU/600 SU,成品为每剂≤5 EU),且后2种方法既能用于定性检测也能用于定量检测,特别是mKCA法下鲎试剂用量更少。结论mKCA法是检查该疫苗内毒素浓度的最适宜方法,具有灵敏度高、稳定性强、鲎试剂用量少、数据完整和可追溯、人为操作误差较小的特点。

人外周血IL-35表达水平与新型冠状病毒疫苗免疫保护效果相关性分析

目的 通过研究被接种者外周血中IL-35的表达水平与被接种者免疫保护的相关性,探讨影响新型冠状病毒疫苗免疫应答可能的原因。方法 选取180名于2021年2月至12月在我院接种门诊全程规范接种新型冠状病毒疫苗健康者,接种完3针后,于第6周采集静脉血。离心收集血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其中新型冠状病毒疫苗抗体水平以及接种前、接种完3针后第6周血清中IL-35的浓度。对接种前后血清中IL-35的浓度比较分析,同时用Pearson对血清中新型冠状病毒疫苗抗体水平与接种后血清中IL-35的浓度进行相关性分析。结果 180名受试者在接种疫苗后第6周血清抗体检测结果为6名阴性,其余174名受试者均为阳性。接种前血清IL-35浓度为(11.56±20.47) pg/mL,接种后第6周血清IL-35浓度为(133.46±54.97) pg/mL,接种后血清IL-35浓度明显高于接种前(P<0.01);被接种者第6周血清抗体含量与血清IL-35浓度进行相关性分析结果表明两者呈正相关(R2=0.883,P<0.01)。结论 外周血IL-35浓度与机体产生新型冠状病毒抗体水平成正相关。

自然杀伤细胞及其免疫激活对防治新型冠状病毒感染机遇与挑战

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的急性传染病。SARS-CoV-2新变异株不断出现,且COVID-19在全世界范围内仍然处于散发和流行状态,亟需研发一种新的、高效的治疗性药物或疫苗。自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)可直接杀伤被病毒感染的靶细胞,其分泌的细胞因子发挥的免疫调节功能在炎症反应中发挥着重要作用,目前回输NK细胞治疗感染性疾病的安全性和有效性已经得到证实。NK细胞有望成为防治COVID-19非常有潜力的新型药物。本文通过对NK细胞及其免疫激活在COVID-19中的作用进行综述,以寻求防治COVID-19的新思路。

微量鲎试剂动态显色法定量检测重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)细菌内毒素的研究

目的研究微量动态显色法用于重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)中细菌内毒素定量检测的可行性。方法使用微量动态显色法鲎试剂,建立细菌内毒素标准曲线,通过干扰预实验确定稀释倍数,测定供试品溶液中外加内毒素的回收率进行干扰试验,完成供试品中细菌内毒素含量的定量检测试验。并与凝胶法试验结果进行比较。结果标准曲线的线性范围为0.02~2.0EU·mL^(-1),回归方程为lgT=-0.3027 lgC+2.8587,r=0.9989,供试品在稀释40倍时均对反应无干扰作用,细菌内毒素回收率在50%~200%范围内,三批供试品的内毒素定量检测结果均符合规定。检测结果与凝胶法一致,符合标准规定。结论微量动态显色法可用于重组新型冠状病毒疫苗(CHO细胞)细菌内毒素定量检测,结果准确,灵敏度高,过程可控。

动物细胞培养技术在新型冠状病毒疫苗研发中的应用

目前,大部分病毒疫苗的生产都需要借助细胞培养的方式来实现,通过动物细胞大规模培养已实现商业化的疫苗有口蹄疫、狂犬病、乙型肝炎疫苗等。自新型冠状病毒爆发以来,世界各国加快了其疫苗的生产。本文对我国已投入市场的灭活疫苗、病毒载体疫苗以及重组蛋白疫苗生产过程中用到的细胞培养技术进行分析,探讨细胞培养技术在新型冠状病毒疫苗研发中的应用。

消化道肿瘤患者接种新型冠状病毒疫苗后免疫原性的预测模型构建

目的:本研究旨在寻找影响消化道肿瘤患者血清抗体滴度降低的主要因素,并应用诺曼图构建预测模型。方法:我们采用单因素和多因素Logistic回归分析筛选消化道肿瘤患者血清抗体滴度降低的独立危险因素。基于回归分析的结果,以回归系数为基础,建立了相应的诺曼图预测模型,我们通过一致性指数(C-index)值、曲线下面积(AUC)、校准曲线和决策曲线分析(DCA)来评估诺曼图的性能和区分能力。结果:多因素Logistic回归分析显示,性别、ASA评分、进行积极治疗和化疗是新冠病毒中和抗体低的独立危险因素,ASA评分和化疗是RBD抗体低的独立危险因素。两种模型之间无统计学差异。我们使用Bootstrap方法进行了内部验证,NABS抗体模型的C指数为0.803,RBD抗体模型的C指数为0.799。校准曲线显示,患者的实际血清学阳性率与预测的血清学阳性率一致。临床决策曲线的结果表明,这两种预测模型在临床上是有用的。结论:这项研究提供了两个诺模图,可以预测胃肠道癌症患者的血清学反应。每个诺模图代表新冠肺炎疫苗的一种抗体,其中包含一些危险因素。它们方便为后续接种新冠疫苗的消化道肿瘤患者并提供参考信息。

成人接种2剂新冠灭活疫苗12个月后T细胞免疫应答特点

目的评估成年人接种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)灭活疫苗12个月后不同抗原特异性T细胞免疫应答的特点。方法解放军总医院第五医学中心2022年4-6月招募15名健康成年人,于接种2剂新冠灭活疫苗12个月后采集其静脉血标本,以基于多色流式细胞术的活化诱导标记法(AIM)检测SARS-CoV-2抗原特异性T淋巴细胞水平,并分析其记忆表型与亚群分化特点。结果成年人接种2剂灭活疫苗12个月后,90%以上个体可检测到Spike及Non-spike特异性CD4^(+)T细胞反应(S:14/15,P=0.0001;NS:15/15,P<0.0001);80%个体检测到Spike及Non-spike特异性CD8^(+)T细胞反应(S:12/15,P=0.0463;NS:12/15,P=0.0806)。抗原特异性CD4^(+)T细胞主要表现为中央记忆细胞(CM)、1型效应记忆细胞(EM1)记忆表型,以及1/17型辅助性T细胞(Th1/17)、2型辅助性T细胞(Th2)辅助表型。结论灭活疫苗接种后能诱导广泛且持久的抗原特异性CD4^(+)T细胞反应,可能是当前国内新型冠状病毒感染重症化比例较低的关键因素。

新型冠状病毒疫苗接种者血清抗体水平变化及与外周血淋巴细胞亚群的相关性

目的观察新型冠状病毒疫苗(后简称新冠疫苗)接种者血清抗体表达水平变化,分析中和抗体水平与外周血淋巴细胞亚群的相关性。方法选择56例完成第二剂新冠灭活疫苗接种者纳入疫苗组,同时纳入未接种疫苗的志愿者20例作为对照组。疫苗组于接种第2剂疫苗后3 d、6~8 d、13~15 d、28~35 d,对照组于入组后检测血清新型冠状病毒抗体IgM、IgG、中和抗体、总抗体;接种疫苗13~15 d后通过流式细胞术测算两组外周血淋巴细胞亚群比例及绝对计数,分析疫苗组中和抗体水平与外周血淋巴细胞的相关性。结果疫苗组血清IgM、IgG、中和抗体水平高于对照组(P均<0.01)。疫苗组接种后3 d、6~8 d、13~15 d、28~35 d中和抗体阳性率分别为20.0%、100%、100%、85.7%。疫苗组接种后6~8 d、13~15 d血清IgM水平高于接种后3 d,接种后6~8 d、13~15 d、28~35 d血清IgG、中和抗体、总抗体水平均高于接种后3 d(P均<0.05)。疫苗组CD3^(+)T细胞比例低于对照组,CD3^(+)CD4^(+)T、CD3^(+)CD8^(+)T、CD3^(-)CD19^(+)B细胞比例高于对照组(P均<0.05)。疫苗组中和抗体水平与CD3^(+)T细胞、CD3^(+)CD8^(+)T细胞比例呈正相关(r分别为0.307、0.333,P均<0.05),与CD3^(+)CD4^(+)T细胞比例、CD4/CD8比值呈负相关(r分别为-0.224、-0.331,P均<0.05)。结论新冠疫苗接种后能够促进IgM抗体表达,提高IgG、中和抗体、总抗体水平,中和抗体水平与CD3^(+)T细胞、CD3^(+)CD8^(+)T细胞比例及CD3^(+)CD4^(+)T细胞比例、CD4/CD8比值有一定相关性。

接种重组新型冠状病毒疫苗后的不良反应

目的探讨接种重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)后的不良反应及对其进行相应的护理措施。方法将2021年2—3月期间在某院接种重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)的1 212例接种者作为研究对象,观察其在接种重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)后出现的不良反应,并探讨对其进行相应的护理措施。结果 1 212例接种重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)后,有28例接种者出现发热、4例接种者出现注射部位肿痛、2例接种者出现恶心、1例接种者出现头晕、1例接种者出现口唇发麻。经对其进行相应的护理干预后,所有出现的不良反应症状均得到有效缓解。结论接种重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)后,出现不良反应的症状主要以发热和注射部位肿痛为主。对出现不良反应的接种者进行相应的护理干预,可有效地缓解其不良反应的症状。

重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)致肝功能损伤1例

1病例摘要患者,女性,41岁,身高164 cm,体质量55 kg。2021年3月10日,排除禁忌证,按照自愿原则,左上臂三角肌肌内注射重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)(军事科学院军事医学研究院生物工程研究所康希诺生物股份公司,批号:NCOV202101001H)0.5 mL,注射后在留观室观察30 min,无异样后离开。

基于毕赤酵母制备的SARS-CoV2RBD-重组蛋白疫苗的免疫方案优化及不同佐剂对中和抗体滴度的影响

目的对基于毕赤酵母制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD重组蛋白疫苗的免疫方案进行优化并考察不同佐剂对中和抗体(NAb)滴度的影响,为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供参考。方法将RBD基因片段亚克隆至pPICZαA质粒,质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达,将获得的重组蛋白疫苗联合不同的佐剂对小鼠进行免疫以评估其免疫原性。结果目标蛋白wtRBD和Delta RBD均能通过毕赤酵母系统获得满意过表达;与42 d间隔时间相比,28 d间隔时间的IgG抗体滴度增加了1.8倍(44923 vs.80507);间隔28 d的3剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度比间隔42 d高2.5倍(2191 vs.891);Delta RBD重组蛋白疫苗联合铝佐剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度达到了32255(2167~88084);在采用5μg或30μg Delta RBD免疫情况下,铝佐剂+CpG佐剂组的NAb滴度均为单独采用铝佐剂组的10倍左右;第3次免疫后,5μg抗原组与30μg抗原组中Delta RBD特异性IgG滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论基于毕赤酵母制备的wtRBD或Delta RBD都可以用作有效的抗原,间隔28 d的3剂疫苗给药最有效,Delta RBD重组蛋白与铝佐剂+CpG佐剂的联合免疫能够获得更高滴度的NAb以对SARS-CoV-2及其变体发挥免疫作用,可为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供一定参考。

重组新型冠状病毒疫苗致急性化脓性扁桃体炎、咽炎1例

1例39岁女性患者,左上臂三角肌肌肉注射重组新型冠状病毒疫苗0.5 mL,共1次。用药后第二天,出现发烧,并伴咽痛充血,扁桃体Ⅱ度肿大,悬雍垂水肿,口腔疱疹等症状,考虑为重组新型冠状病毒疫苗导致的急性化脓性扁桃体炎、咽炎。立即要求患者住院治疗,经过头孢米诺联合依替米星抗感染,蒲地蓝消炎口服液抗病毒治疗,浓替硝唑含漱液、康复新液漱口对症处理,10天后,白细胞、中性粒细胞百分比和超敏C反应蛋白均正常,次日,患者出院。提示医务人员需密切注意患者迟发型不良反应,确保患者用药安全。

新型冠状病毒疫苗激发T淋巴细胞免疫作用的优势探讨

【目的】探讨新型冠状病毒疫苗(简称“新冠疫苗”)激发T淋巴细胞的免疫作用的优势。【方法】通过分析新型冠状病毒(简称“新冠病毒”)原始株、德尔塔变异株和奥密克戎变异株不同时段潜伏期百分构成与mRNA新冠疫苗、新冠灭活疫苗相应预防感染及发病效果,论证T细胞免疫与B细胞免疫激发时程和相关实验。【结果】mRNA新冠疫苗预防感染及发病与新冠病毒潜伏期≥5 d百分构成一致,新冠灭活疫苗预防感染及发病与新冠病毒潜伏期≥8 d百分构成一致,mRNA新冠疫苗预防新冠病毒引起的早期感染及发病更有效。【结论】mRNA新冠疫苗细胞内激发T细胞免疫比新冠灭活疫苗细胞外激发B细胞免疫更快。

新型冠状病毒肺炎患者外周血淋巴细胞亚群变化的临床意义

目的:探讨新型冠状病毒(以下简称新冠)肺炎患者外周血淋巴细胞亚群百分比及细胞绝对计数改变与其临床特征间的关系。方法:回顾性分析2022年4月25日至6月5日期间上海交通大学医学院附属第九人民医院收治的244例新冠肺炎患者临床资料,并按疾病分型(轻型、普通型、重型)、疫苗接种情况及合并基础疾病进行分组,采用流式细胞术检测各组淋巴细胞不同亚群[CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞、CD16+CD56+自然杀伤(natural kill,NK)细胞以及CD19+B淋巴细胞]绝对值及百分比,分析外周血淋巴细胞亚群改变与患者临床特征间的关系。结果:与新冠肺炎轻型组比较,重型组患者各淋巴细胞亚群绝对值均显著下降(P<0.05),CD3+T淋巴细胞百分比下降(58.0%比66.0%,P<0.05);与普通型组相比,重型组患者的CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B淋巴细胞绝对值下降(P<0.05),CD3+T淋巴细胞百分比下降(58.0%比68.6%,P<0.05)。与未接种新冠疫苗的患者相比,接种疫苗者的CD3+T(1 061个/μL比858.2个/μL)、CD3+CD4+T(514.4个/μL比645.1个/μL)、CD19+B(151.7个/μL比249.6个/μL)淋巴细胞绝对值上升(P<0.05),CD19+B淋巴细胞百分比上升(11.7%比15.4%,P<0.05)。与无基础疾病组相比,合并高血压/糖尿病患者的CD3+T(1 063个/μL比891.4个/μL)、CD3+CD4+T (637.7个/μL比540.3个/μL)、CD3+CD8+T (353.3个/μL比299.5个/μL)、CD19+B (253.7个/μL比154个/μL)淋巴细胞绝对值下降(P<0.05),CD19+B淋巴细胞百分比下降(14.1%比11.8%,P<0.05)。结论:新冠肺炎患者淋巴细胞亚群的改变与患者的症状轻重、疫苗接种史以及基础疾病史密切相关,重症、合并基础疾病和未接种疫苗者各淋巴细胞亚群绝对值及百分比下降,其下降可能提示患者免疫功能降低,故检测淋巴细胞亚群水平变化对新冠肺炎患者的诊治、评估病情进展及预后可能有重要的参考价值。

腺病毒载体重组新型冠状病毒疫苗通用体外生物学活性检测方法的建立及验证

目的建立通用、稳定的腺病毒载体重组新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome 2,SARS-CoV-2)疫苗的体外生物学活性检测方法,并对其进行方法学验证。方法利用实验室之前筛选出的ELISA试剂盒筛选不同的细胞、细胞浓度和感染剂量,从而建立通用体外生物学活性检测方法并进行相对准确度、中间精密度、线性和范围的验证。结果建立了通用体外生物学活性检测方法,筛选出HEK293细胞为适宜感染用细胞,其铺板细胞浓度为8×10^(5)个/mL,细胞感染剂量是1.0×10^(7) VP。该方法经不同人员和日期检测验证,每个效价水平的相对偏倚应均在±30%内,水平效价测定值的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)≤30%,疫苗效价理论值(对数)与其相应的效价测定值(对数)作图并进行线性回归计算,直线回归方程的相关系数r≥0.95,效价水平范围在50%~200%,证明能满足对多种SARS-CoV-2变异株腺病毒载体疫苗的检定需要。结论建立了通用、稳定的腺病毒载体SARS-CoV-2疫苗体外生物学活性检测方法,该方法可应用于腺病毒载体SARS-CoV-2疫苗的质量控制。

新型冠状病毒及其疫苗的研发

目的 介绍新型冠状病毒和进入Ⅲ期临床试验或者已经开始使用的SARS-COV-2疫苗的研发进展。方法 通过PubMed、ProQuest等文献检索网站,以国内外大量文献为依据,归纳总结出全球多个国家新型冠状病毒疫苗的研发情况。结果 世界范围内多个国家的新型冠状病毒疫苗研发都有较大的进展;中国已有2个灭活疫苗投入使用;美国有4个新冠疫苗进入Ⅲ期临床试验;俄罗斯也已将其研发的疫苗投入使用。结论 全球都在争分夺秒的研发新冠疫苗,截至目前,世界范围内进入Ⅲ期临床的新型冠状病毒疫苗已有12种,其中中国、美国的新冠疫苗研发进度处于领先状态。

新型冠状病毒重组蛋白疫苗中受体结合域二聚体纯度检测方法的建立及验证

目的建立应用生物分析仪(Agilent 2100)检测新型冠状病毒重组蛋白疫苗中受体结合域(receptor-binding domain,RBD)二聚体纯度的方法,并对其进行验证。方法对新型冠状病毒重组蛋白疫苗进行解析附后,超滤浓缩蛋白,采用生物分析仪(Agilent 2100)检测完全及非完全变性(二硫键保留)蛋白的纯度;对建立的方法进行系统适用性、专属性、重复性、中间精密度和准确度验证后,用其检测厂家A 4批样品。结果系统适用性验证中,8个峰均可清晰区分基线;空白溶剂在目标成分出峰位置无干扰,专属性良好;在非完全和完全变性条件下,2名实验员12次重复检测结果的RSD均小于1%,重复性和中间精密度良好;3种不同蛋白浓度(50%、80%和100%)主峰(1+2)及主峰面积占比的RSD分别为0.68%和0.31%,准确度良好,其中,10%蛋白浓度样品结果不稳定;4批样品RBD二聚体纯度分别为70.5%、70.2%、73.2%和69.6%。结论建立的方法专属性、精密度、准确度良好,可用于重组蛋白疫苗中蛋白纯度的检测。

3种平台Delta-Omicron嵌合RBD二聚体新型冠状病毒疫苗的免疫原性头对头比较

新型冠状病毒(新冠病毒)在全球范围内流行,对公共卫生和人民生命健康造成了巨大威胁,新冠病毒疫苗的研发和使用对预防疾病和控制疫情起到了关键作用.基于包括重组蛋白亚单位、病毒载体、mRNA脂纳米颗粒在内的多种技术平台开发的疫苗都获得了使用.然而,由于抗原设计的差异、免疫剂量和注射间隔的差别,不同疫苗平台之间的免疫效果无法直接比较.因此,本研究以Delta-Omicron嵌合RBD二聚体为免疫原,对广泛使用的3个疫苗平台(重组蛋白亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗和mRNA疫苗)进行了免疫原性头对头比较,通过小鼠模型比较了它们同源接种和序贯接种所诱导的体液免疫和细胞免疫反应的差异.结果显示,小鼠在免疫同源的两剂疫苗后,m RNA疫苗诱导的结合抗体和中和抗体滴度都最高,其次分别是重组蛋白亚单位疫苗和腺病毒载体疫苗;异源加强免疫的结果显示,不管是以重组蛋白亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗或者mRNA疫苗初免,以mRNA疫苗作为第2针加强免疫均能诱导更强的体液免疫反应.此外,在疫苗激发的细胞免疫方面,mRNA疫苗诱导了较强的CD4^(+)T细胞反应,腺病毒载体疫苗诱导了较强的CD8^(+)T细胞反应,而亚单位疫苗刺激的细胞免疫反应以CD4^(+)T细胞为主,但在强度上较弱.本研究具有重要的应用价值,为未来新一代的新冠病毒疫苗研发和接种策略提供了指导.

新型冠状病毒Beta变异株S1重组蛋白的制备及免疫效果评价

根据CHO细胞密码子偏好性进行SARS-CoV-2 Beta变异株S1基因的优化与合成,并将其克隆至pSN载体,构建重组表达质粒pSN-Beta-S1,转染CHO细胞,获得重组蛋白Beta-S1,通过SDS-PAGE和Western blot方法鉴定重组蛋白Beta-S1的表达,对培养液上清进行亲和层析纯化。将纯化后的重组蛋白Beta-S1联合氢氧化铝佐剂免疫BALB/c小鼠,检测血清中特异性IgG抗体及其亚型,评价针对SARS-CoV-2不同变异株的交叉中和抗体活性。结果显示,成功构建pSN-Beta-S1重组质粒,经CHO细胞表达系统表达了重组蛋白Beta-S1,重组蛋白条带单一,大小约为120 kDa,纯度可达85%以上,可与SARS-CoV-2 RBD蛋白多克隆抗体和Strep标签单克隆抗体特异性结合。S1重组蛋白对BALB/c小鼠具有良好的免疫原性,第3次免疫后14 d,针对RBD和S1蛋白的特异性IgG抗体效价平均可达1∶66260和1∶133120,抗体亚型偏向于IgG1,针对SARS-CoV-2野生株,Beta、Delta、Omicron BA1和Omicron BA2变异株的中和抗体分别为1∶629、1∶1720、1∶374、1∶77和1∶101。本研究利用CHO细胞表达系统成功制备了SARS-CoV-2 Beta变异株S1重组蛋白,免疫BALB/c小鼠后获得了良好的免疫原性和针对不同变异株的交叉中和抗体活性,为广谱SARS-CoV-2疫苗的研究提供了一定的借鉴意义。

浅析我国首款鼻喷新型冠状病毒疫苗生产质量监管要点

黏膜免疫系统是机体抵御病毒和细菌感染的第一道防线,在抵抗感染方面发挥着重要的作用。其中鼻黏膜免疫在呼吸道传染病预防方面具有独特优势,已成为疫苗研究热点。自新型冠状病毒疫情暴发以来,新型冠状病毒疫苗研发中已有多条技术路线采用了鼻腔免疫方式。本文对我国首款鼻喷新型冠状病毒疫苗的生产质量监管要点进行总结,以期为今后鼻喷疫苗的生产质量监管提供借鉴参考。