荧光定量PCR检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组DNA的残留量

目的：建立real—timePCR定量检测毕赤酵母基因组DNA残留量的方法，提高重组新蛭素的产品安全性。方法：选择拷贝数高且分布广泛的毕赤酵母5SrRNA基因为靶标基因设计扩增引物，提取酵母基因组DNA，稀释后作为扩增模板。以罗氏荧光定量PCR_Light Cycler 480平台为基础，建立基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的real—timePCR的检测方法，并考察用该方法检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组残留量的灵敏度、精密度和回收率。结果：该法检测宿主DNA残留量灵敏度高，DNA浓度为0．1～1000pg／μL范围内呈现良好的线性关系，其标准曲线的误差值小于0．2；用该法对5批注射用重组新蛭素（酵母）产品中宿主基因组DNA残留量进行了测定，结果分别为0．03、2.3、0.2、0．6、0．2μg／mg。结论：该方法具有操作简便、灵敏度高等优点，可用于重组产品中酵母基因组残留DNA的定量测定。

注射用重组新蛭素的质量控制研究

目的:建立注射用重组新蛭素原液、成品的质量控制方法及内控质量标准。方法:利用纤维蛋白凝块法测定注射用重组新蛭素的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC测定纯度,SDS-PAGE和质谱法分析相对分子质量,免疫印迹验证目的蛋白,其余检测项目按《中华人民共和国药典》(2010年版三部)规定进行。结果:用建立的方法对注射用重组新蛭素3批原液和成品进行了检定,原液抗凝比活性均为512 ATU/mg,非还原型SDS-PAGE和HPLC检测3批原液的纯度结果均大于95%;质谱法分析3批原液相对分子质量符合7.3×103±0.7×103,SDS-PAGE分析3批原液相对分子质量符合13.2×103±1.3×103;免疫印迹表明检测条带为目的蛋白,能被抗水蛭素抗体特异性结合;其余各项指标均符合内控质量标准及《中华人民共和国药典》(2010年版三部)的要求。结论:建立的质量控制方法和内控质量标准可以用于注射用重组新蛭素的检定和质量控制。

HPLC法定量测定酵母发酵上清液中重组新蛭素的含量

目的建立HPLC技术定量测定发酵上清液中重组新蛭素(EH)含量的方法,用于监测发酵过程中EH的表达量变化与诱导时间的关系,使EH产量最大化。方法利用HPLC技术建立EH的检测方法,通过对该方法的灵敏度、精密度和加标回收率实验的考察,确立该方法的可行性;利用该方法对EH样品进行稳定性考察,并对酵母发酵上清液进行跟踪检测。实现了对发酵过程中发酵上清液中EH的实时监测。结果 EH在214 nm处有较强的特异性吸收峰,其吸收峰面积与含量存在很好的线性关系,r^2=0.9995,EH线性浓度范围在0.012~4.8 mg/ml。该测定方法具有很好的精密度,样品多次重复测定的RSD值为1.4227%;加标回收率在95%~98%。应用该方法对EH样品的稳定性测定结果显示,样品4℃保存稳定性较好,24 h内样品主峰面积百分比>95%,在20℃条件下,8 h内样品稳定性良好,主峰面积百分比>95%。该方法准确度高、重复性好,进行测定时,可根据EH的特异吸收峰,对发酵过程中发酵上清液中EH含量进行实时定量测定。测定结果显示,在一定时间范围内,EH的表达量与诱导时间成正相关。结论本研究建立了HPLC技术检测EH含量的方法,该方法可用于发酵过程中EH的实时定量监测,使EH的产量达到最大值,为EH的临床样品制备提供有力支持。