重组旋毛虫53000蛋白在M0型巨噬细胞极化中的作用及机制

目的探讨重组旋毛虫53000蛋白在M0型巨噬细胞极化中的作用及机制。方法获取骨髓来源的M0型巨噬细胞为研究对象,以650、700、750和800μg/mL浓度的重组旋毛虫53000蛋白干预M0型巨噬细胞,检测比较不同浓度干预24、48和72 h后的细胞因子信号传导抑制因子3(SOCS3)、M1型巨噬细胞表面特异性标记物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及M2型巨噬细胞标志物(FIZZ1)等mRNA表达量的变化,分析三者表达水平之间的关系。重组旋毛虫53000蛋白干预72 h后采用流式细胞仪分别检测各组巨噬细胞标志物CCR7(M1型)及CD206(M2型)比例。结果随着重组旋毛虫53000蛋白干预时间的延长,各组SOCS3表达量升高而iNOS和FIZZ1表达量降低,且同一时间点随着重组旋毛虫53000蛋白浓度升高,SOCS3表达量升高而iNOS和FIZZ1表达量降低(P<0.05)。Pearson线性相关分析结果显示,各浓度重组旋毛虫53000蛋白干预M0型巨噬细胞的SOCS3与其iNOS和FIZZ1表达量均呈负相关(P<0.05)。重组旋毛虫53000蛋白干预72 h后,流式细胞仪检测结果显示随着重组旋毛虫53000蛋白浓度的升高,FITCCD206(+)巨噬细胞比例亦不断升高,各浓度间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论重组旋毛虫53000蛋白可能通过调控SOCS3表达诱导M0型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化且极化趋势具有一定的剂量依赖性。

旋毛虫抗原基因Ts21的原核表达与重组蛋白鉴定

目的原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr)21000抗原基因(Ts21)并对重组蛋白进行纯化和抗原性鉴定。方法将旋毛虫抗原基因Ts21亚克隆入原核表达载体pMAL-c2X,构建重组表达质粒pMAL-c2X-Ts21,经酶切鉴定正确后转化大肠埃希菌TB1,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。亲和层析法纯化表达产物。应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定重组蛋白的抗原性。将重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度,免疫荧光检测(IFA)确定Ts21蛋白在肌幼虫体内的分布。结果SDS-PAGE结果显示,表达产物为Mr63500的重组融合蛋白,IPTG诱导4h后表达量最大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18.2%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,但不能被乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及伪旋毛虫感染小鼠血清识别;与钩虫病、囊尾蚴病、日本血吸虫病患者血清无交叉反应,但与并殖吸虫病、华支睾吸虫病及棘球蚴病患者血清有交叉反应。重组蛋白免疫小鼠可产生高滴度的血清抗体,IFA显示Ts21蛋白主要分布于肌幼虫体壁。结论成功制备了旋毛虫Ts21基因的重组蛋白,该蛋白具有较好的抗原性。

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p4 6kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。 方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以 2 0 μg/只的剂量分 3次免疫小鼠后 ,攻击感染旋毛虫肌幼虫 2 0 0条 /只 ,检查旋毛虫 7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染 35d的肌幼虫数并计算减虫率 ,同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果 WN10免疫小鼠后获得旋毛虫 7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为 6 4 .2 8%和 6 1.2 1% ,均与感染对照组和佐剂对照组差异显著 ;获得雌虫产新生幼虫的减虫率为 16 .4 6 % ,与感染对照组和佐剂对照组差异不显著 ;WN10免疫组小鼠在第 3次免疫后 1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG ,在攻击感染旋毛虫 9周后仍维持在较高水平。 结论 编码旋毛虫新生幼虫 p4

旋毛虫Ts87重组蛋白诱发小鼠保护性免疫的研究

为了进一步探讨旋毛虫Ts87基因原核表达重组蛋白的保护性免疫作用 ,本试验用此纯化重组蛋白组分加福氏完全佐剂 (FCA)皮下注射免疫NIH小鼠 3次 ,继以旋毛虫感染性幼虫 2 5 0条攻击 ,攻击后每周取血清测抗体IgG滴度 ,第 35天计数小鼠肌肉幼虫数。结果显示重组蛋白免疫鼠的肌肉幼虫减虫率为4 2 3% ,血清抗Ts87重组蛋白体IgG的几何平均倒数滴度 (GMRT)达到 80 0 0以上 ,均显著高于佐剂组和对照组。

不同佐剂对旋毛虫Ts87重组蛋白免疫小鼠保护性的影响

目的比较福氏完全佐剂(CFA)等6种佐剂对于旋毛虫Ts87重组蛋白(rTs87)免疫保护性的影响。方法经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析鉴定的rTs87分别与上述各种佐剂免疫ICR小鼠,每间隔2周免疫1次,共免疫3次。ELISA检测免疫小鼠血中抗原特异性IgG抗体水平。攻击感染45 d后剖杀小鼠取肌幼虫(ML)并计数,计算肌幼虫减虫率。结果rTs87相对分子质量(Mr)约为40 000,可被旋毛虫感染鼠血清和rTs87免疫鼠血清识别,分别与佐剂CFA(或IFA)、IMS 1312、ISA720、Quil-A及氢氧化铝免疫后均引起较强的IgG抗体反应,各佐剂免疫组减虫率分别为49.4％、49．2％、63．5％、65．1％和70．8％,与空白对照组比较有统计学意义;单纯抗原rTs87免疫组获得了23．7％的减虫率,与对照组及各佐剂免疫组差异均有统计学意义(P<0．05)。结论佐剂CFA(或IFA)、IMS1312、ISA720、Quil-A及氢氧化铝均能不同程度增强rTs87对小鼠的保护性免疫力,其中佐剂ISA720、Quil-A和氢氧化铝的保护效果更好。

旋毛虫抗原基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定

目的原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr)43 000抗原基因(Ts43)并对重组蛋白进行抗原性鉴定。方法将旋毛虫抗原基因Ts43克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Ts43,经测序分析正确后转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting analysis)鉴定重组蛋白的抗原性。结果SDS-PAGE结果显示表达产物为Mr 41 000的重组融合蛋白,IPTG诱导4 h时表达量最大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的14.7%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、乡土旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,与人芽囊原虫、微小隐孢子虫感染小鼠和正常小鼠血清和正常人血清无交叉反应,但与棘球蚴病、囊尾蚴病、日本血吸虫病、并殖吸虫病及华支睾吸虫病患者血清均有交叉反应。结论旋毛虫Ts43基因的重组蛋白具有较好的抗原性,但与某些寄生虫病患者血清有交叉反应。

旋毛虫Ts21重组蛋白的免疫诊断价值及免疫保护作用的研究

目的探讨旋毛虫Ts21重组蛋白的免疫诊断价值及免疫保护作用。方法应用旋毛虫Ts21重组蛋白ELISA(Ts21-ELISA)与肌幼虫ES抗原ELISA(ES-ELISA)对旋毛虫病与其他寄生虫病患者血清及5种旋毛虫(T1、T2、T3、T4和T7)感染小鼠血清进行检测,并观察不同剂量旋毛虫感染小鼠后不同时间的血清抗体水平。将Ts21重组蛋白皮下注射免疫小鼠(20μg/只,免疫3次,每次间隔10d),末次免疫后10d,每只小鼠用300条旋毛虫肌幼虫经口攻击感染,3.5d和42d后剖杀,观察肠道成虫与肌幼虫数并计算减虫率。结果Ts21-ELISA检测旋毛虫病、并殖吸虫病、囊尾蚴病及棘球蚴病患者血清的抗体阳性率分别为94.7%(18/19)、15.8%(3/19)、9.1%(1/11)和7.7%(1/13),与血吸虫病、华支睾吸虫病患者血清及健康人血清无交叉反应;Ts21重组蛋白与ES抗原ELISA检测旋毛虫病患者血清抗体的敏感性与特异性差异均无统计学意义(χ2=0,P>0.05;χ2=0.358,P>0.05)。Ts21重组蛋白与ES抗原检测T1感染小鼠血清的敏感性差异无统计学意义(χ2=0.104,P>0.05),与T2、T3、T4、T7感染小鼠血清的交叉反应率明显低于ES抗原(χ2=17.069,P<0.05)。小鼠感染300条旋毛虫后4周,应用Ts21-ELISA检测的血清抗体阳性率为100%(10/10);小鼠感染5条旋毛虫后6周,血清抗体阳性率为100%(10/10)。Ts21重组蛋白免疫小鼠用旋毛虫攻击感染后3.5d和42d,肠道成虫与肌幼虫减虫率分别为42.71%和49.8%。结论Ts21重组蛋白可用于旋毛虫病的血清学检测,但不能忽视与并殖吸虫病、囊尾蚴病及棘球蚴病患者血清的交叉反应。

以重组蛋白为抗原的ELISA法检测旋毛虫抗体

目的寻求特异性强、敏感性高的旋毛虫病诊断抗原。方法以旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在E.coli高效表达的重组蛋白为抗原,分别以兔、猪和健康者血清及旋毛虫病阳性血清为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、山羊抗猪IgG和山羊抗人IgG为二抗,建立检测旋毛虫抗体的间接ELISA方法,并以旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(ES)抗原作为检测对照。结果以T668重组蛋白为抗原,对兔、猪和人旋毛虫病血清进行检测,阳性检出率为100%,且敏感性高(0.016μg/孔),与ES抗原检测结果完全一致。结论T668重组抗原有望替代ES抗原检测旋毛虫抗体。

旋毛虫P53ES重组蛋白对小鼠的免疫保护作用

为进一步探讨旋毛虫P53基因原核表达重组蛋白的免疫保护作用,本实验采用纯化的重组蛋白作为抗原免疫小鼠,免疫剂量为50μg/100μL,每隔10d免疫1次,共3次。末次免疫后10d,每只小鼠以200条旋毛虫肌幼虫攻虫。分别检查感染后7d小鼠肠道内成虫数量、体外培养雌虫所产新生蚴数量以及感染后35d肌肉荷虫量。结果显示:小鼠肠道内成虫、新生蚴和肌幼虫的减虫率分别为61.9%、53.45%和71.48%,表明旋毛虫表达P53基因的重组蛋白对小鼠产生了较好的免疫保护效果。

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的 原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。 方法 免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET 2 8c(+ ) ,异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清 ,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。 结果 经原核表达的Ts88重组蛋白 ,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应 ,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。 结论 成功制备Ts88基因的重组蛋白 。

旋毛虫排泄分泌抗原53-ku重组蛋白上调M2型肺泡巨噬细胞减轻脓毒症小鼠急性肺损伤

【目的】探讨重组旋毛虫排泄分泌抗原53-ku蛋白(rTsP53)对小鼠急性肺损伤的保护作用及其机制。【方法】采用尾静脉脂多糖注射(LPS,10 mg/kg)建立BALB/c小鼠急性肺损伤模型。在肺损伤后2 h尾静脉注射rTsP53(50μg/只)治疗。统计各组小鼠72 h累计死亡率,HE染色法观察各组小鼠肺脏病理损伤情况,测量肺脏湿/干质量比(W/D),ELISA法检测各组小鼠肺泡灌洗液IL-6和IL-4浓度,RT-PCR法检测各组小鼠肺泡灌洗巨噬细胞TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1的mRNA表达。【结果】经rTsP53蛋白治疗可明显降低急性肺损伤小鼠72 h死亡率,减轻脓毒症小鼠肺脏组织的病理损伤,降低肺脏的湿干重比,降低Smith评分。LPS组小鼠肺泡灌洗液IL-6较空白组升高,而IL-4下降,灌洗巨噬细胞的TNF-α,iNOS的mRNA表达水平较空白组明显升高,而IL-10,Arg-1的mRNA表达水平下降,表现出M1表型极化的特点;经rTsP53蛋白治疗的脓毒症小鼠肺泡灌洗液IL-6浓度下降,IL-4水平上升,灌洗巨噬细胞向M2表型极化,表现为IL-10,Arg-1的mRNA表达水平较脓毒症组明显升高,而iNOS的mRNA表达水平下降。【结论】rTsP53蛋白通过上调M2型巨噬细胞抑制炎症反应和修复组织损伤,对脓毒症小鼠急性肺损伤发挥保护效应。

旋毛虫Ts87重组蛋白诱导的小鼠黏膜免疫保护性研究

本实验探讨旋毛虫Ts87重组蛋白灌胃免疫小鼠诱导的黏膜免疫保护性作用。实验分对照组、佐剂组(霍乱毒素B亚单位组,CTB)和免疫组(CTB+Ts87重组蛋白),灌胃免疫,间隔1周共免疫3次。末次免疫后第7天用400条旋毛虫感染期幼虫攻击,比较3组小鼠肠道成虫数、雌虫生殖力和肌幼虫数。且于末次免疫后第7天刮取肠黏液、取血检测特异性sIgA、IgG抗体水平。结果显示免疫组小鼠成虫减虫率、新生蚴减虫率、肌幼虫减虫率分别是81·34%、67·02%、84·49%;小鼠肠黏液sIgA水平及血清IgG水平显著高于对照组和佐剂组。结果表明Ts87重组蛋白黏膜免疫能够诱导小鼠产生抗旋毛虫的保护性免疫。灌胃免疫能显著提高肠黏液特异性sIgA水平,对促进肠道成虫的排出有明显作用。

Ts21重组蛋白斑点免疫金渗滤法检测旋毛虫抗体的研究

目的应用旋毛虫Ts21基因重组蛋白建立诊断人体旋毛虫病及动物旋毛虫感染的快速血清学方法。方法以胶体金标SPA、旋毛虫Ts21重组蛋白与肌幼虫排泄-分泌(excretory-secretory,ES)抗原包被硝酸纤维素膜(NCM),分别建立Ts21重组蛋白-斑点免疫金渗滤法(Ts21-dot immunogold-filtration assay,Ts21-DIGFA)与ES-DIGFA,对旋毛虫病及其他寄生虫病患者血清和感染动物血清进行检测,并与ELISA检测结果进行比较。结果Ts21-DIGFA检测旋毛虫病患者血清抗体的敏感性和特异性分别为94.73%和86.96%,ES-DIGFA的敏感性和特异性分别为89.47%和86.96%,差异无统计学意义(χ2敏感=0.368,χ2特异=0,P>0.05);Ts21-ELISA的敏感性和特异性分别为94.73%和94.20%,与Ts21-DIGFA相比差异无统计学意义(χ2敏感=0,χ2特异=1.272,P>0.05)。Ts21-DIGFA检测旋毛虫感染猪血清的敏感性和特异性分别为88.89%和100%,ES-DIGFA的敏感性和特异性分别为94.44%和95.00%,差异均无统计学意义(χ2敏感=0,χ2特异=0,P>0.05)。小鼠感染300条旋毛虫后4周Ts21-DIGFA的血清抗体检出率为100%(10/10);感染10条及5条旋毛虫后6周血清抗体检出率均为100%(10/10)。DIGFA可在3 min内肉眼观察结果,抗原包被后的NCM和金标SPA在4℃至少保存6个月。结论Ts21-DIGFA检测旋毛虫抗体具有较高的敏感性和特异性及良好的稳定性和重复性,可用于旋毛虫病的血清学诊断及血清流行病学调查。

旋毛虫p53重组蛋白对血管内皮细胞通透性影响的研究

为研究旋毛虫p53蛋白对血管内皮细胞通透性影响的相关机制,本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVES)为细胞模型,通过体外实验利用不同浓度的旋毛虫p53重组蛋白(Ts-p53)刺激HUVES,采用CCK-8试剂盒筛选Ts-p53刺激HUVES细胞的最适浓度,通过Transwell小室方法检测内皮细胞通透性,利用荧光定量PCR(qPCR)检测细胞凋亡关键因子Bax、Bcl-2以及内皮细胞间连接蛋白Zo-1及VE-cadherin转录水平的变化,利用western blot方法检测细胞凋亡关键因子Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Pro-Caspase-9、cl-Caspase-9、Pro-Caspase-3、cl-Caspase-3以及内皮细胞间连接蛋白Zo-1及VE-cadherin蛋白表达量的变化。结果显示,Ts-p53刺激HUVES细胞的最适浓度为60μg/mL。随着Ts-p53对HUVES细胞作用时间的增加,FITC标记的白蛋白在感染3 h、6 h时内皮通透性Pa值逐渐上升,在12 h时尤为明显,并与空白对照组相比差异极显著(P<0.01),在刺激18 h时渗出指数下降。阳性对照组为LPS刺激HUVES,该组HUVES内皮通透性Pa值约为空白对照组HUVES的1.9倍(P<0.01)。表明Tsp53可以诱导HUVES通透性的增加。qPCR和western blot结果显示,与空白对照组相比,Ts-p53刺激3 h、6 h、12 h,Bax的转录水平和表达水平呈时间依赖性增加,在刺激12 h时其转录水平和表达水平最高(P<0.01),18 h时其转录水平和表达水平降低,阳性对照组Bax转录水平和表达水平极显著高于其他组(P<0.01)。与空白对照组比,Bcl-2的转录水平和表达水平呈时间依赖性减少,在刺激12 h时其转录水平和表达水平最低(P<0.01),18 h时其转录水平和表达水平均增加,阳性对照组Bcl-2转录水平和表达水平均低于其他组。在刺激12 h时,Bax/Bcl-2值最低。Western blot结果显示,与空白对照组相比,Cytochrome C表达水平也随着时间增加而增高,在12 h表达量最大,18 h表达量减少,阳性对照组该蛋白表达水平高于其他组,差异极显著(P<0.01)。随着刺激时间的增加,Caspase-3和Caspase-9蛋白被活化成cl-Caspase-3和cl-Caspase-9,均在12 h时变化最为显著(P<0.01),进一步验证了细胞凋亡的发生。与空白对照组相比细胞间连接蛋白ZO-1及VE-cadherin的转录水平和表达水平均呈时间依赖性减少,在12 h表达量最少(P<0.01)。综上所述,本研究首次证实Ts-p53可以通过引发细胞凋亡、破坏内皮细胞间连接蛋白两种方式破坏内皮细胞屏障,使血管内皮细胞通透性增加,该结果为旋毛虫感染发病机制的研究奠定了基础。

抗旋毛虫P53ES蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗旋毛虫的单克隆抗体(MAb),以旋毛虫P53ES基因的重组蛋白免疫BALB/c鼠,经ELISA筛选和有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株。亚类鉴定2株MAb均属IgM亚类,其轻链均为κ链;腹水效价均达到1:104以上;Western blot证实2株MAb均能与约53ku处的ES抗原反应,出现特异性条带;杂交瘤细胞株连续传代,细胞生长良好,效价稳定;所得MAb与隐孢子虫、猪鞭虫、猪囊尾蚴囊液抗原、多头蚴囊液、日本血吸虫抗原均无交叉反应。抗旋毛虫P53ES蛋白的MAb的制备,为旋毛虫病的研究和研制旋毛虫病诊断试剂盒奠定了基础。

旋毛虫HSP70蛋白诱导大鼠心肌细胞线粒体凋亡机制的研究

为了解旋毛虫HSP70致心肌损伤的机制,本研究将不同浓度旋毛虫重组HSP70蛋白(Ts-Hsp70)与大鼠心肌细胞H9c2共孵育后,采用CCK-8试剂盒筛选Ts-Hsp70作用H9c2细胞的最适浓度。以最适浓度Ts-Hsp70与H9c2细胞共孵育不同时间后,采用微孔板法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,采用比色法检测细胞培养上清液中心肌细胞损伤标志物肌酸激酶(CK)的含量,采用免疫荧光检测Ts-Hsp70作用后H9c2细胞活性氧(ROS)的释放,采用qPCR和western blot方法检测Ts-Hsp70作用后的H9c2细胞线粒体凋亡与抗凋亡途径中的Bax、Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome C与Bcl-2的基因转录水平与蛋白表达水平。结果显示,经最适浓度为60μg/mL的Ts-Hsp70分别刺激H9c2细胞6 h、12 h和18 h后,随着Ts-Hsp70对H9c2细胞作用时间的延长,LDH、CK、ROS含量与Bax、Cytochrome C及激活状态下的Caspase-3、Caspase-9基因转录水平与蛋白表达水均升高,且均于作用12 h时达峰值,显著高于对照组(P<0.01),而线粒体抗凋亡基因Bcl-2基因转录水平与蛋白表达水平随着Ts-Hsp70对H9c2细胞作用时间的延长均逐渐降低,且均于作用12 h时达谷值,显著低于对照组(P<0.01)。本研究首次证实Ts-Hsp70可增加细胞中LDH、CK、ROS的含量,激活并调节H9c2细胞中的线粒体凋亡通路,该研究结果为进一步研究旋毛虫致心肌损伤机制提供了基础数据。

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的 获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。 方法 旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入 PET- 2 8a(+)表达载体 ,异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物 ,SDS- PAGE、 EL ISA和 Western blotting对表达产物进行分析鉴定 ,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果 SDS- PAGE结果显示 ,表达产物为分子量约为 4 0 k Da的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别 ,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。 结论 获得一个新的旋毛虫成虫 Ts87基因重组蛋白 ,该蛋白具有特异的抗原性。

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达(英文)

目的 观察编码旋毛虫相对分子质量 (Mr) 3 10 0 0抗原的DNA疫苗 (重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。 方法 通过用阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞 ,G418筛选阳性克隆 ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、间接荧光抗体试验 (I FAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)对表达产物进行鉴定。 结果 RT PCR结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在 876bp处有一条带 ,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带 ,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示 ,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约 3 10 0 0的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。 结论 重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞 ,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达 ,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫?

旋毛虫新生幼虫WN1抗原基因的克隆及表达

应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,对阳性克隆WN1序列进行生物信息学分析。结果表明,WN1cDNA全长为474bp,含有1个354bp的完整的开放阅读框架(ORF),编码的多肽由117个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为13200,等电点为4.25,N-末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白。GenBank数据库检索结果显示,此序列为一个新基因的全长cDNA。经PCR扩增WN1基因,将其克隆到原核表达载体pET28a,重组质粒经鉴定后,转化大肠杆菌BL21star(DE3)并诱导表达出相对分子质量为15000的重组蛋白,与理论设计完全相符。

重组旋毛虫53000抗原蛋白通过激活M2型巨噬细胞减轻脂多糖对肝脏的损害

目的 研究重组旋毛虫53 000抗原蛋白（rTsP53）是否通过激活M2巨噬细胞减轻脂多糖（LPS）所致肝损害.方法 60只雄性BALB/c小鼠,按随机数字表法分为LPS组、LPS＋磷酸盐缓冲液（PBS）组及rTsP53干预组,每组20只.3组动物禁食8h后腹腔注射15 μg/kg LPS;LPS＋ PBS组在注射LPS后1h注射等量PBS;rTsP53干预组在注射LPS后1h注射5 mg/kg rTsP53蛋白.干预后48 h处死小鼠,提取腹腔巨噬细胞,用流式细胞仪检测巨噬细胞标志物CCR7（M1型）及CD206（M2型）表达变化;取肝脏组织制作切片,苏木素-伊红（HE）染色观察病理改变,双染色免疫荧光检测F4/80（＋）HLA-DR（＋）及F4/80（＋）CD163（＋）表达情况;取外周血,检测血清天冬氨酸转氨酶（AST）及丙氨酸转氨酶（ALT）水平.结果 与LPS组、LPS＋ PBS组比较,rTsP53干预组小鼠生存率明显提高（90％比25％、30％,均P＜0.01）;肝脏病理损害减轻,组织结构明显改善;血清ALT、AST水平明显降低[ALT （U/L）：97.7±8.5比181.7±19.5、173.7±17.2,AST（U/L）：142.7±12.1比235.7±9.9、213.7±6.7,均P＜0.05];腹腔巨噬细胞FITC-CD206（＋）比例明显升高[（17.75±0.30）％比（1.38±0.13）％、（1.36±0.05）％,均P＜0.05],腹腔巨噬细胞PE-CCR7（＋）比例明显下降[（6.89±0.11）％比（15.30±0.64）％、（14.96±0.93）％,均P＜ 0.05];肝组织切片内F4/80（＋）CD163（＋）细胞表达荧光强度明显增强（0.36±0.01比0.29±0.02、0.31±0.01,均P＜0.05）,而F4/80（＋）HLA-DR（＋）荧光强度则无明显差异（0.30±0.01比0.30±0.02、0.31±0.01,均P＞0.05）.LPS组与LPS＋ PBS组各指标比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）.结论 rTsP53蛋白可以通过促进体内M2型巨噬细胞活化,减轻LPS所致肝组织损害,提高动物生存率.