应用重组日本血吸虫组织蛋白酶L诊断日本血吸虫病的研究

在大肠杆菌BL2 1中表达日本血吸虫组织蛋白酶L基因 ,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组日本血吸虫组织蛋白酶L ;以间接ELISA法 ,检测血吸虫病因牛血清 10 4份 ,阳性检出率为 6 7 31% ;以血吸虫感染小鼠、兔、绵羊血清做阻断试验 ,得到的OD值与阴性血清相当。结果表明 ,以重组日本血吸虫组织蛋白酶L作为诊断抗原检测日本血吸虫病牛感染情况 ,有一定的应用前景。

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因的编码区全序列分析及克隆

目的 分析日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因编码区的完整序列,并定向克隆到真核表达质粒pcD-NA3中。 方法 从日本血吸虫成虫提取总RNA,进行反向巢式RT-PCR,T载体克隆后测序。PCR扩增SjCL1基因的编码区序列,并将扩增产物克隆到pcDNA3质粒的BamHI和Xhol位点上。结果 通过反向巢式RT-PCR扩增出332 bp SjCL1基因5’端序列,测序后与报道的SiCL1基因部分序列拼接,可得到一个编码317个氨基酸的完整编码区序列。PCR特异性扩增出SjCL1编码区基因序列,其大小约为1 kb。经酶切、PCR鉴定和测序表明所构建的质粒pcDNA-SjCL1中含有所扩增的基因序列。 结论 构建了含SjCL1基因的编码区序列的真核表达质粒pcDNA-SjCL1。

巢式RT-PCR分析日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)的基因5’末端序列

目的 测定日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因的 5’端序列。 方法 从日本血吸虫成虫中提取总RNA ,以该RNA为模板 ,进行巢式RT -PCR ,扩增SjCL1基因 5’端序列。将其与 pMD18-T载体连接得到含SjCL1基因 5’端序列的重组质粒 ,并测定上述DNA插入片段的序列。结果 通过巢式RT -PCR扩增出 332bpSjCL1基因 5’端序列 ,测序后 ,与报道的SjCL1基因部分序列拼接后 ,可得到一个编码 317个氨基酸的完整开放阅读框。 结论 使用巢式RT -PCR技术 ,扩增得到SjCL1基因的 5’端序列。为进一步对其进行功能研究奠定了基础。

日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因巴氏毕赤酵母表达载体的构建

目的 扩增SjCL2基因 ,构建巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2 ,为进一步研究其蛋白酶的功能奠定基础。方法 运用RT -PCR技术 ,从日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫总RNA中扩增获得SjCL2基因 ;将其定向克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB质粒 ;经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序分析SjCL2基因并确定其读码框的正确插入。结果 利用RT -PCR技术从日本血吸虫成虫总RNA中扩增到约 1Kb大小的SjCL2基因 ,通过双酶切分析、PCR鉴定以及DNA序列分析确定SjCL2基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB中。 结论 成功构建了含有SjCL2基因编码区序列的巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因在大肠埃希菌中的表达

目的 在原核表达体系大肠埃希菌中进行日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因表达。 方法 通过PCR从质粒pcDNA3 SjCL1中扩增得到SjCL1基因 ,定向克隆至原核表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组质粒pGEX SjCL1,将该重组质粒转化大肠埃希菌JM10 9,转化子经异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达 ,采用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析SjCL1基因表达产物。 结果 获得长约 1kb的PCR片段 ,构建了pGEX SjCL1质粒。SDS PAGE和Westernblotting检测表达产物 ,相对分子质量为 62 0 0 0。

日本血吸虫组织蛋白酶L2基因扩增及克隆

目的 体外扩增日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L2 (SjCL2 )的编码区基因序列 ,将其克隆到真核表达质粒pcDNA3中 ,为进一步对其进行功能研究奠定基础。方法 用TRIZOL分离日本血吸虫成虫RNA ,RT -PCR扩增目的基因 ,将扩增产物定向克隆到真核表达载体 pcDNA3中。 结果 RT -PCR特异性扩增出SjCL2编码区基因序列 ,其片段大小为1kb左右 ,经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pcDNA -SjCL2中含有所扩增的基因序列。 结论 RT -PCR扩增的SjCL2编码区基因序列与预期长度相符合 ,成功构建了含SjCL2编码区基因的真核表达质粒pcDNA -SjCL2。

重组白细胞介素-4增强日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗诱导小鼠的保护力

目的探讨重组白细胞介素-4(IL-4)真核表达质粒增强日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。方法将小鼠IL-4基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1以构建小鼠重组IL-4表达质粒,并联合日本血吸虫组织蛋白酶B的表达质粒DNA(VR1012-Sj31)肌注免疫小鼠,设重组IL-4表达质粒、组织蛋白酶B表达质粒和2种空载体质粒对照组。免疫组化检测IL-4和组织蛋白酶B在小鼠肌细胞内的表达,末次免疫3周后攻击感染,用减虫率及减卵率表示保护力。结果重组IL-4和组织蛋白酶BDNA均在小鼠肌细胞表达,重组IL-4和组织蛋白酶BDNA联合免疫小鼠,产生43.2%的减虫率和76.6%的减卵率,与组织蛋白酶BDNA单独免疫相比差异有显著性(P<0.01,P<0.05)。结论重组IL-4能提高日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗的抗血吸虫保护力作用,具有佐剂的免疫效应。

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗与IL-4真核表达质粒联合免疫诱导小鼠保护性的研究(英文)

目的 观察日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗与IL 4真核表达质粒联合免疫小鼠的效果。 方法 将小鼠IL 4基因PCR扩增片段克隆入真核表达载体pcDNA3以构建重组表达质粒。小鼠分为 4组 ,每组 12只 ,实验组 (A)每鼠肌注组织蛋白酶BDNA疫苗和IL 4表达质粒各 10 0 μg ,同时设立组织蛋白酶BDNA疫苗对照组 (B)、IL 4表达质粒对照组 (C)和空载体对照组 (D) ,共免疫 3次。 2周后用免疫组化检测表达质粒在小鼠肌细胞的表达 ,3周后经皮肤攻击感染小鼠 40± 1条日本血吸虫尾蚴。计算减虫和减卵率 ,观察免疫保护性。 结果 重组IL 4质粒和组织蛋白酶BDNA疫苗均在小鼠肌细胞表达。用重组IL 4质粒和组织蛋白酶BDNA疫苗联合免疫诱导小鼠产生 43 .2 0 %的减虫率和 76.63 %的减卵率 ,与组织蛋白酶BDNA疫苗单独免疫比较差异均有显著性 (P <0 .0 0 1,P <0 .0 5 )。 结论 联合IL 4表达质粒免疫可能提高日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗的抗血吸虫保护性免疫。

阳离子脂质体介导日本血吸虫组织蛋白酶L1基因的真核表达

目的真核表达日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)以研究其生物学功能。方法采用阳离子脂质体复合质粒SjCL1/AD1-1 DNA并转染HeLa细胞,通过RT-PCR检测SjCL1基因在HeLa细胞中的转录,SDS-PAGE电泳法分析目的基因的蛋白表达产物,并进一步通过Western Blot法证实。结果RT-PCR检测到转染的细胞中有与目的基因相符大小约1000bp转录条带,SDS-PAGE电泳发现表达质粒SjCL1/AD1-1DNA转染的细胞上清液中存在大小约为31kDa的表达蛋白带,Western Blot法证实该表达蛋白产物可和日本血吸虫兔血清发生特异的反应。结论阳离子脂质体将SjCL1/AD1-1转染入HeLa细胞后可特异地表达一个大小约为31kDa的可分泌的日本血吸虫蛋白产物。

日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗抗生殖免疫的研究

目的 探讨日本血吸虫组织蛋白酶ＢＤＮＡ疫苗的保护。方法 分别用Ｓｊ３１ＢＩＮ免疫昆明鼠和ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠，攻击感染后６ｗ 计数成虫负荷及粪便和组织内虫卵数。结果 用构建的Ｓｊ３１ＢＩＮ免疫小鼠可影响成虫发育，肝组织减卵率为５９－３％～６５－０％ ，肠组织减卵率为５７－６％ ～６２－１％ ，粪便减卵率为８６－５％ 。结论 Ｓｊ３１ＢＩＮ 可诱导小鼠产生抑制雌虫生殖的免疫力。

日本血吸虫31kDa组织蛋白酶B DNA疫苗保护性免疫效果观察

目的 观察日本血吸虫 31k Da组织蛋白酶 B DNA疫苗 (Sj31B1 N)在小鼠体内的保护性免疫效果。方法 用 Sj31B1 N和 Sj31B1 N +p UC DNA疫苗肌注免疫 BAL B/ C小鼠 ,用空白质粒载体VR10 12做对照 ,在 0、4、8周共免疫 3次 ,每次免疫前及末次免疫后 4周从尾静脉采血收集血清 ,经EL ISA法检测小鼠血清抗体升高时 ,用日本血吸虫尾蚴攻击感染小鼠。结果 Sj31B1 N和 Sj31B1 N+p U C减虫率分别为 2 4.2 %和 2 2 .0 % ;肝卵减少率分别为 34 .9%和 39.5 % ,每雌肝卵减少率分别为 30 .4%和 35 .3%。结论 小鼠接种 Sj31B1 N后对日本血吸虫感染有减虫、减卵作用及抗雌虫生殖的作用。加质粒佐剂 p

日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶基因的获得及结构与功能分析

目的 从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)中国大陆株 (chinesemainlandstrain)成虫cDNA文库中获得日本血吸虫新基因 -组织蛋白酶B内切酶基因 (CathepsinBendopeptidase) ,利用生物信息学技术对其结构和功能进行分析和预测。方法 从已构建好的日本血吸虫成虫cDNA文库中挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取全长cDNA ,并进行生物信息学分析和登录 ;使用NCBI,SAPS ,TMHMM ,Signal,PsortII,Protscale和Scanprosite等软件对新基因的结构和功能进行分析和预测。结果 对 382个阳性克隆进行测序 ,获得部分新基因 ,其中包括组织蛋白酶B内切酶基因(AY2 2 6 984 )。利用Internet在线分析和相关生物信息学软件对新基因的结构和功能进行了分析和预测。结论 日本血吸虫组织蛋白酶B内切酶基因所编码蛋白为一跨膜蛋白 ,含有半胱胺酸蛋白酶结构域 ,可能对宿主血红蛋白具有降解作用 ,从而在日本血吸虫生长。

晚期日本血吸虫病患者肝组织基质金属蛋白酶2和9的表达

目的 研究基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)在晚期日本血吸虫病患者肝组织中的表达及意义。方法 26例晚期日本血吸虫病患者肝活检标本和5例正常人肝标本行常规病理检查,用MMP-2、MMP-9和Ⅳ型胶原(G-Ⅳ)单克隆抗体进行免疫组织化学染色进行定量和定位研究。结果 MMP-2主要表达在肝细胞浆、肝细胞膜和肝窦,肌成纤维细胞和血管内皮细胞也有表达。MMP-9主要表达在肝星状细胞、肝窦和肌成纤维细胞,偶见肝细胞浆和胆管上皮细胞表达。晚期日本血吸虫病患者肝组织MMP-2、MMP-9和G-Ⅳ的表达明显高于正常人(P<0.05),随着汇管区炎症活动度和肝纤维化程度的升高,MMP-2的表达也明显增强(P<0.01),MMP-9的表达无明显改变(P>0.05),C-Ⅳ表达与MMP-2呈同步关系。结论 MMP-2与日本血吸虫病肝纤维化的发生、发展有关,MMP-9表达与日本血吸虫病肝纤维化的发生有关。

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗的免疫保护效果研究

目的 :观察已构建日本血吸虫大陆株 31kDa组织蛋白酶BDNA疫苗VR1 0 1 2 Sj31及VR1 0 1 2 SjGST Sj31在BALB c小鼠体内的免疫保护效果。方法 :用纯化的空白质粒载体VR1 0 1 2、重组质粒VR1 0 1 2 Sj31及VR1 0 1 2 SjGST Sj31于股四头肌注射免疫BALB c鼠 :将 36只 6～ 8周龄BALB c鼠随机分为 3组 ,每组 1 2只 ,对照组 (A组 )注射空白质粒载体VR1 0 1 2 ,B组注射重组质粒VR1 0 1 2 Sj31 ,C组注射重组质粒VR1 0 1 2 SjGST Sj31。质粒剂量均为 1 0 0 μg ,每隔 2周免疫 1次 ,共免疫 3次 ,第 3次免疫后第 2 1天 ,每只鼠经腹部感染 1 0条尾蚴 ,4 2天后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数 ,观察诱导产生的减虫和减卵效果 ,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体。结果 :ELISA分析表明 ,第 3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体。与空白质粒对照组比较 ,2个实验组的减虫率分别为 2 5 0 %及 30 0 % (P <0 0 5 ) ,肝组织减卵率分别为 5 4 90 %及 6 9 74 % (P <0 0 0 1 ) ,每雌肝减卵率分别为 4 7 96 %、5 4 6 2 % (P <0 0 0 1 )。与B组相比 ,C组的肝组织减卵率为 32 92 % (P <0 0 0 1 ) ,每雌肝减卵率为 1 2 79% (P <0 0 5 )。结论 :DNA疫苗VR1 0 1 2 Sj31和VR1 0 1 2 SjGST Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗?

日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗血清抗体与抗生殖免疫关系的初步研究

目的 探讨日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗 (Sj31B1N)抗生殖免疫的可能机理。 方法 用Sj31B1N免疫小鼠 ,每 2周 1次 ,每次免疫前均尾静脉采血 1次 ,作血清抗体动态变化分析 ,免疫 4次后尾蚴攻击感染。感染后 4 5天 ,计数成虫负荷和肝、肠组织内虫卵数。结果 用Sj31B1N免疫小鼠后第 2周部分小鼠血清中出现了抗体 ,随时间延长 ,出现抗体阳性组小鼠数量增多 ,抗体滴度增加。抗体阳性组小鼠与阴性组小鼠对比 ,成虫减少率为 4 0 .6% ,肝组织减卵率为 4 8.0 % ,肠组织减卵率为 4 5.4 %。结论 核酸疫苗Sj31B1N可有效地诱导小鼠产生抗体 ,并且具有免疫保护作用。核酸疫苗Sj31B1N所诱导的体液免疫可能是抗日本血吸虫生殖免疫的机理之一。

日本血吸虫组织蛋白酶的研究

目的：鉴别日本血吸虫组织蛋白酶类型及其水解蛋白活性。方法：收集日本血吸虫成虫肠道排出物，用含精氨酰键的特异性人工合成底物识别排出物中组织蛋白酶的类型及活性。结果：成虫肠道排出物能降解组织蛋白酶Ｂ的特异性底物７－氨基－４－甲基香豆素（Ｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＡＭＣ）和组织蛋白酶Ｂ及Ｌ的共同底物Ｚ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＭＣ。组织蛋白酶Ｌ的抑制剂Ｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＣＨＮ２能部分抑制排出物对Ｚ－ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＭＣ的降解作用。日本血吸虫组织蛋白酶Ｂ／Ｌ的最适ｐＨ为５．０－５．５。结论：日本血吸虫成虫排出物具有组织蛋白酶Ｂ和Ｌ样活性。

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗不同免疫途径免疫保护效果研究

目的 :观察本室所构建日本血吸虫大陆株 31kDa组织蛋白BDNA疫苗在BALB/c小鼠体内的不同免疫途径的免疫保护效果。方法 :用纯化的空白质粒载体VR1 0 1 2、重组质粒VR1 0 1 2 Sj31免疫BALB/c鼠 ,将 36只 6～ 8周龄BALB/c鼠随机分为 3组 ,每组 1 2只 ,对照组 (A组 )肌肉注射空白质粒载体VR1 0 1 2 ,实验组 (B组 )皮下注射重组质粒VR1 0 1 2 Sj31 ,C组肌肉注射重组质粒VR1 0 1 2 Sj31。质粒剂量均为 1 0 0 μg ,每隔 2w免疫 1次 ,共免疫 3次 ,第 3次免疫后第 2 1d ,每只鼠经腹部感染 1 0条尾蚴 ,4 2d后剖杀计数各小鼠成虫数和每克肝卵数 ,观察诱导产生的减虫和减卵效果 ,并用ELISA分析小鼠血清中的抗体。结果 :ELISA分析表明 ,第 3次免疫后小鼠出现特异性IgG抗体。与空白质粒对照组比较 ,2个实验组的减虫率分别为 1 5 .0 % (P >0 .0 5 )和 2 5 .0 % (P <0 .0 5 ) ,减卵率分别为 38.2 2 %和 5 4.90 % (P <0 .0 0 1 )。与皮下免疫组相比 ,VR1 0 1 2 /Sj31肌肉免疫组的减卵率分别为 2 6 .99% (P <0 .0 0 1 )。结论 :DNA疫苗VR1 0 1 2 Sj31能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用 ,肌肉注射的保护效果大于皮下注射。

日本血吸虫组织蛋白酶B2在小鼠抗血吸虫再感染中的作用

目的构建日本血吸虫组织蛋白酶B(Sjcb2)真核表达载体,检测日本血吸虫组织蛋白酶B2单独和联合吡喹酮(PZQ)在小鼠抗血吸虫再感染中的作用。方法将60只BALB/c雌性小鼠随机均分为六组,建立日本血吸虫感染动物模型:感染组、感染攻击组、空质粒处理组、Sjcb2免疫组、吡喹酮处理组、Sjcb2联合吡喹酮处理组。Sjcb2免疫组和Sjcb2联合吡喹酮组分别在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接种pcDNA3.1(+)/Sjcb2重组质粒,空质粒处理组接种pcDNA3.1(+)空质粒。初次尾蚴感染后第六周,对吡喹酮处理组和Sjcb2联合吡喹酮处理组小鼠给予PZQ治疗。除感染组外其它各组在第八周再次进行尾蚴攻击感染。分别于第8周和第14周取各组小鼠肝脏组织做病理切片,观察虫卵肉芽肿大小;采用间接ELISA法检测血清中特异性IgE和IgG亚型(IgG1,IgG2和IgG3);检测各组小鼠荷成虫数,计算抗血吸虫再感染率。结果 Sjcb2免疫组、联合组与其它组分别比较,小鼠荷虫数显著性减少,抗血吸虫再感染率显著升高,虫卵肉芽肿直径显著减小,IgG1水平显著下降和IgE水平显著升高(P<0.01)。结论 Sjcb2在小鼠模型中具有抗日本血吸虫再感染作用,抗血吸虫再感染率为70.3%,抗再感染作用机制可能与特异性IgE水平升高和IgG1水平下降有关。

中国明对虾组织蛋白酶L的原核重组表达及其组织分布

组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了组织蛋白酶L基因,为了进一步研究组织蛋白酶L的组织分布及其功能,对该基因进行了重组表达。将中国明对虾组织蛋白酶L基因的酶原片段亚克隆进原核表达载体pET30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,其分子量在40kD左右,与期望的中国明对虾组织蛋白酶L的分子量一致。表达产物形成包涵体,经过对包涵体变性和复性,并进行His-tag柱亲和纯化,得到了纯化的蛋白。利用重组蛋白制备了的兔抗血清。Western实验表明,组织蛋白酶L在中国明对虾的肝、胃、肠中有表达,而在卵巢中没有表达。

槲皮素抑制小鼠血吸虫病肝组织即早基因和基质金属蛋白酶组织抑制因子1的表达

分别运用槲皮素及吡喹酮治疗小鼠日本血吸虫肝纤维化。槲皮素治疗后小鼠肝纤维化程度减轻,肝组织中即早基因c-fos与c-jun及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量均明显低于感染对照组;与吡喹酮组相比,c-junmRNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显降低,而c-fosmRNA、TIMP1含量无显著改变,提示其远期抗血吸虫肝纤维化效果优于吡喹酮。