重组杀菌/渗透增强蛋白21在体内抗感染免疫作用的研究

本文介绍了rBPI2 1在革兰氏阴性菌败血症、慢性渗出性耳炎、下肢缺血再灌注损伤后并发症三种动物模型和临床创伤性失血及其并发症、肝部分切除术后、脑膜炎菌血症患者体内抗感染免疫作用的研究结果。提示rBPI2 1作为一种新型的抗菌蛋白 。

重组杀菌渗透性增加蛋白21在大鼠内毒素血症中保护机制的研究

目的探讨重组杀菌渗透性增加蛋白21(rBPI21)在大鼠内毒素血症中保护效应的机制。方法给内毒素血症大鼠注射不同剂量的rBPI21,动态观察rBPI21不同剂量组大鼠血液中内毒素(LPS)、脂多糖结合蛋白(LBP)、肿瘤坏死因子α(TNFα)含量的变化。结果rBPI21治疗1组(rBPI21剂量为0.625 mg/kg)大鼠,6、12 h血浆LPS含量明显低于内毒素组大鼠相同时间点LPS含量(P<0.01),血清LBP、TNFα含量各检测时间点均明显低于内毒素组大鼠相同时间点的含量(P<0.01);与内毒素组大鼠相比,rBPI21治疗2、3、4组(rBPI21剂量分别为1.25、2.5、5.0 mg/kg)大鼠各检测时间点血浆LPS,血清LBP、TNFα含量均明显降低,大鼠24 h生存率由内毒素组的16.7%分别上升到58.3%、91.7%、100.0%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论rBPI21对内毒素血症大鼠的保护作用机制主要是通过促进体内LPS的聚合和清除,降低LPS活性,从而抑制LBP的生成,减少TNFα等细胞因子的过度表达。

重组杀菌渗透性增加蛋白21在大鼠内毒素血症中保护机制的探讨

目的探讨重组杀菌渗透性增加蛋白21(rBPI21)在大鼠内毒素血症中保护效应的机制。方法给内毒素血症大鼠注射不同剂量的rBPI21,动态观察rBPI21不同剂量组大鼠血液中内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量的变化。结果rBPI21治疗1组(rBPI21剂量为0.625mg/kg)大鼠,6,12h血浆LPS含量明显低于内毒素组大鼠相同时间点LPS含量(P<0.01),血清TNF-α含量各检测时间点均明显低于内毒素组大鼠相同时间点的含量(P<0.01)。与内毒素组大鼠相比,rBPI21治疗2、3、4组(rBPI21剂量分别为1.25,2.5,5.0mg/kg)大鼠各检测时间点血浆LPS、血清TNF-α含量均明显降低(P<0.01)。结论rBPI21对内毒素血症大鼠的保护作用机制主要是通过促进体内LPS的聚合和清除,降低LPS活性,减少TNF-α等细胞因子的过度表达。

杀菌/渗透性增强蛋白功能及应用前景

杀菌/通透性增强蛋白(BPI)是存在于中性粒细胞中的阳离子蛋白,约为55 kD.BPI能与革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖结合,增加外膜对抗菌药的通透性,具有特异性杀灭革兰氏阴性菌及结合/中和内毒素的生物学功能,在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有良好的发展前景.近年来,国内外对BPI研究颇多,并逐渐发现BPI还具有调理作用、抗真菌、抗原虫和抑制血管生成等许多功能,被学者称为未来的"超级抗生素".本文主要就BPI的结构、分布、生理功能、作用机理及临床研究方面的研究进展作一综述.

杀菌/渗透增强蛋白功能区抗菌肽与内毒素亲和性的SPR技术检测

目的:研究杀菌/渗透增强蛋白(BPI)不同功能区抗菌肽与内毒素(LPS)结合的能力。方法:设计、合成来自杀菌/渗透增强蛋白N端不同功能区的3段抗菌肽,分别为BPI22-36、BPI85-99和BPI147-161,将其固定于CM5蛋白质芯片上,使用表面等离子共振(SPR)仪检测3种抗菌肽与LPS和类脂A(Lipid A)相互作用的情况。结果:3种抗菌肽中,BPI147-161与LPS和Lipid A结合的能力最强,BPI85-99次之,但BPI22-36与其不结合;BPI147-161与Lipid A的亲和常数KA为1.12×106L/mol,相比,多黏菌素B(PMB)的亲和常数KA为5.58×106L/mol。结论:来自杀菌/渗透增强蛋白的抗菌肽BPI147-161能有效地中和内毒素,这可能为败血症休克的治疗提供一种新的策略。

人杀菌/渗透增强蛋白N端功能片段基因突变文库的构建和鉴定

目的为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI_(23)对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI_(600)进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI_(600)基因突变体库。方法通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI_(600)随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI_(600)的随机突变率。再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,将质粒进行HindⅢ/XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况。结果测序和基因比对显示,BPI_(600)经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3%;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI_(600),表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI_(600);在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI_(23)编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失。氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变。3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白。结论成功构建pYD1-shuffled BPI_(600)重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础。

杀菌/渗透增强蛋白基因转染小鼠受到大肠杆菌攻击后结肠粘膜上皮离子转运的变化机制

目的:杀菌通透性增加蛋白嵌合基因(BPI700-Fcγ1700)转染的小鼠,给予感染最小致死剂量(MLD)的大肠杆菌,观察和探究结肠上皮电阻和离子转运的变化和机制。方法利用基因转染、短路电流记录、ELISA测定技术,记录转基因小鼠结肠粘膜的基础电流、电压以及给予促分泌物对上皮离子转运的影响。结果基因转染小鼠与对照组相比,结肠上皮基础电阻和短路电流明显增加,在上皮的顶膜侧加入钠离子通道阻断剂阿米洛利后,则可以明显抑制增加的电阻;应用上皮离子促分泌物forskolin后,可以明显增加结肠上皮的短路电流,这种短路电流可以被氯离子通道阻断剂DPC、Na+-K+-2Cl-共转运体抑制剂bumetanide明显抑制;并且forskolin作用结肠粘膜后上皮cAMP的含量明显高于对照组。结论基因转染小鼠结肠上皮阴离子转运明显增加,从而促进了肠道排毒反应,这可能是转基因小鼠对致死性大肠杆菌抵抗力增加的原因之一。本研究为革兰氏阴性菌感染的研究和治疗提供了理论基础。

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。

毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段

目的探讨在毕赤酵母中进行杀菌/渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达。方法从质粒pUCm-BPI上PCR扩增得到编码BPI氨基端196个氨基酸的基因片段(BPI588)。将该基因克隆到酵母表达载体Ppic9K上,使其准确融合于α交配因子分泌信号之后,电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-。对酵母重组子的基因组DNA作PCR和总RNA作RT-PCR分析。筛选出的转化子用甲醇作诱导物在29℃进行诱导后,分泌到培养基中的表达产物用于革兰氏阴性细菌E.coliJM109的抑菌实验。结果BPI588基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中,并有转录产物mRNA的存在,表达产物能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。结论利用毕赤酵母进行杀菌/渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达是可行的。

杀菌/渗透增强蛋白在小鼠组织器官和细胞中的分布

目的探讨生理状态和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下,杀菌渗透增强蛋白(murine bactericidal/permeability-increasing protein,muBPI)在小鼠组织器官和细胞中的表达情况。方法①实验小鼠分为3组,即LPS未刺激组、LPS刺激组和阴性对照组;②制备小鼠心、肝、脾、肺、肾、胸腺、睾丸、小肠组织切片和骨髓细胞、腹腔灌洗细胞、骨髓源树突状细胞涂片;③采用免疫组化方法检测muBPI在上述组织器官和细胞中的表达。结果①LPS未刺激组小鼠睾丸、小肠、肾脏组织切片和骨髓细胞、腹腔灌洗细胞、骨髓源树突状细胞涂片均呈黄色着染;LPS刺激后上述组织切片和细胞涂片呈棕黄或深棕色着染;阴性对照组呈现非特异微弱黄色背景着染;②LPS未刺激组小鼠肺、肝组织切片呈微弱黄色背景着染;LPS刺激后上述组织切片呈棕黄色着染;阴性对照呈微弱黄色背景着染;③其余器官组织切片在LPS刺激或未刺激组均呈现与阴性对照组相同的非特异微弱黄色背景着染。结论①生理状态下,小鼠睾丸、小肠、肾脏、骨髓细胞、腹腔灌洗细胞和骨髓源树突状细胞可组成性表达BPI蛋白,LPS刺激后BPI蛋白表达量显著增高;②生理状态下,小鼠肺、肝组织不表达BPI蛋白,LPS可诱导上述组织表达BPI蛋白;③其余组织器官在生理状态下和LPS刺激后均不表达BPI蛋白。

杀菌/渗透增强蛋白的分子结构和主要生物学功能

杀菌 /渗透增强蛋白 (BPI)分子呈“飞镖”状结构 ,其N端和C端功能区中具有两个非极性磷脂结合口袋。目前认为 ,BPI与细菌脂多糖 (LPS)之间的结合主要与以下因素有关 :①疏水基团的作用 :即LPS疏水性乙酰基链与BPIN端口袋中非极性侧链间的相互作用 ;②静电作用 :BPIN端功能区氨基酸携带的正电荷与LPS类脂A携带的负电荷之间的相互作用。BPI主要生物学功能如下 :①对革兰阴性菌 (GNB)的抑制和杀伤作用 ;②对游离LPS的结合 /中和作用 ;③促进补体活化。

BPI_(m23)重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的 :采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm2 3抗菌蛋白。方法 :利用构建的pUC1 8 synBPI4 1 4质粒和PBV2 2 0 BPIm4 2 0 质粒 ,按分子克隆方法构建pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;用线性化pPICZα synBPIm6 0 0 质粒电转化PichiapastorisGS1 1 5 ,筛选抗性转化子 ,进行PCR和Mut表型鉴定 ;用甲醇诱导目的蛋白rBPIm2 3的表达 ;用离子交换层析纯化rBPIm2 3,并进行SDS PAGE分析、Westernblot鉴定和用BCA法定量。结果 :①成功构建了pPICZα synBPIm6 0 0 重组表达载体 ;②获得稳定整合目的基因的GS1 1 5菌株 ;③表达产物相对分子量约为 2 3kD ,可与抗BPI抗体特异性结合 ;④培养上清液中目的蛋白表达量约为 2 9mg L。结论 :BPIm2 3重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS1 1 5中得到分泌表达。

小鼠BPI N端功能片段(muBPI_(25)蛋白)体外杀菌和中和内毒素作用研究

目的:建立胞内杀菌和体外中和内毒素实验模型,检测muBPI25目的蛋白对胞内寄生菌的抑杀作用和对内毒素的中和作用。方法:将pcDNA3.1(+)-muBPI36-259质粒导入RAW264.7细胞,用胞内寄生G+/G-菌感染上述细胞建立muBPI25目的蛋白胞内杀菌实验模型;将pSecTag2B-muBPI36-259与双荧光素酶报告基因质粒共转染RAW264.7细胞,建立体外检测muBPI25蛋白中和内毒素实验模型。结果:胞内杀菌实验模型证实muBPI25目的蛋白对G-伤寒杆菌具有抑杀作用;中和内毒素实验模型证实muBPI25目的蛋白对内毒素具有中和作用。结论:首次证实小鼠BPI N端功能片段,即muBPI25目的蛋白对G-菌具有抑杀作用,对其裂解产物内毒素具有中和作用。

提高重组抗菌蛋白BPI_(23)在E.coli中表达水平和复性率的研究

目的:提高重组抗菌蛋白BPI23在E.coli D H 5α中的表达水平及提纯后蛋白的复性率。方法:通过降低目的基因5'端序列中G C含量和构建双拷贝重组表达载体pBV 220-(synBPI6002),减少低频密码子数目和增加目的基因拷贝数,并采用不同复性方法对提纯后的蛋白进行复性。结果:降低目的基因5'端序列中GC含量后,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的14.3%;单双拷贝重组表达载体转化E.coli DH 5α后,目的蛋白的表达水平无明显差异;在复性液中加入PEG 4000后,目的蛋白产生聚集沉淀较少。结论:减少目的基因中GC含量可显著提高BPI23的表达水平,增加表达载体中目的基因的拷贝数对其表达水平无影响,在蛋白复性液中加入PEG 4000可明显抑制蛋白聚集沉淀。

小鼠BPI N端功能基因片段的克隆及其表达产物的胞内杀菌作用

目的:克隆小鼠BPI36-259基因片段,转染细胞获得具有杀菌作用的目的抗菌蛋白。方法:采用生物信息学方法,构建PUC57-muBPI1-281质粒;PCR扩增获得muBPI36-259基因片段,制备pcDNA3.1(+)-muBPI36-259重组质粒;采用电穿孔法将上述重组质粒转染RAW264.7细胞,Western blot法检测目的蛋白在胞内的表达;建立胞内杀菌实验模型,检测muBPI36-259目的蛋白对胞内寄生菌(伤寒杆菌)的杀伤作用。结果:muBPI36-259目的蛋白在RAW264.7细胞内成功表达,对胞内寄生菌-G-伤寒杆菌具有杀伤作用。结论:成功克隆了小鼠BPI36-259基因片段,转染RAW264.7细胞获得具有生物学活性目的抗菌蛋白。

无功能垂体腺瘤中杀菌/渗透增强折叠家族蛋白B1基因的表达及其对肿瘤侵袭性的作用研究

目的探讨无功能垂体腺瘤中杀菌/渗透增强折叠家族蛋白Bl(BPIFBl)基因的表达情况及其对垂体腺瘤增殖和侵袭性的影响;方法利用高通量基因表达(GEO)公共数据库垂体腺瘤芯片的数据,通过生物信息学分析方法筛选出侵袭性相关基因;然后选取5例侵袭性无功能垂体腺瘤和5例非侵袭性无功能垂体腺瘤的组织标本,通过实时荧光定量PCK和免疫组织化学染色检测BPIFBI基因和蛋白的表达情况。在垂体腺瘤GH3细胞株中通过siRNA敲减BPIFB1的表达,采用细胞活性和细胞划痕实验等检测肿瘤细胞的增殖和迁移能力;采用实时荧光定量PCR测定基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA的表达水平;采用蛋白质免疫印迹技术检测上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达水平t结果生物信息学分析结果提示,侵袭性垂体腺瘤中BPIFB1的表达水平低于非侵袭性垂体腺瘤(log2FC=-5.29,P<0.01);免疫组织化学染色结果显示,侵袭性无功能垂体腺瘤中BPIFB1的表达水平(0.53±0.10)明显低于非侵袭性无功能垂体腺瘤(1.02±0.44)(P<0.05);实时荧光定量PCR结果显示,BIMFBl mRNA的表达水平与肿瘤KnSp分级呈负相关(r_(s)=-0.88,P<0.01)。细胞活性实验结果显示,BPIFB1敲减GH3细胞的细胞活性(2.98±0.14)高于正常GH3细胞(2.14±0.05)(P<0.01);细胞划痕实验结果显示,BPIFB1敲减GH3细胞的迁移率[(43.82±3.74)%]高于正常0113细胞[(17.53±2.05)%](P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,BPIFBI敲减GH3细胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表达水平均高于正常GH3细胞(均P<0.05);蛋白质免疫印迹实验显示,BPIFB1敲减GH3细胞中EMT相关蛋白的表达水平与正常GH3细胞比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论侵袭性无功能垂体腺瘤中BPIFBI的表达水平降低,BPIFB1可能通过调控MMP的表达及EMT来抑制肿瘤的增殖和侵袭能力。

杀菌/渗透增强蛋白mRNA在大鼠体内的分布

目的研究杀菌/渗透增强蛋白(BPI)mRNA在正常大鼠体内的存在情况,为了解和临床应用BPI提供重要的信息。方法从大鼠不同器官和组织的匀浆中提取总RNA,合成第1链cDNA,利用PCR扩增大鼠BPI的DNA片段。结果遍及全身的21种器官和组织中,肾、卵巢、睾丸、肝脏、小肠、大肠、胸腺、脾脏和白细胞等9种器官中均能检测到BPI的mRNA,其中,在睾丸中最为丰富,在肝脏、大肠中也较为丰富。结论BPI的mRNA在正常大鼠体内多个器官和组织中都存在,提示它在机体内控制细菌感染的作用较为广泛。

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。

环磷酰胺对抗菌蛋白的影响

目的:研究环磷酰胺对正常大鼠体内抗菌蛋白m RNA表达水平的影响,以进一步了解环磷酰胺的免疫抑制机制。方法:给大鼠腹腔注射环磷酰胺(40mg/kg),连续5天;对照组注射等体积的生理盐水,制模成功后从大鼠不同器官和组织的匀浆中提取合成DNA片段,在凝胶电泳的胶上观察PCR产物条带。结果:BPI、β-DF-1、血小板型PLA2在NS组中表达的器官数及含量均较CTX组要低。结论:环磷酰胺对抗菌蛋白的表达产生抑制作用,提示环磷酰胺对机体的免疫抑制作用不仅通过抑制骨髓,也通过抑制体内抗菌蛋白的表达来完成。

内毒素血症中脂多糖相关蛋白的混合调节机制

目的:研究内毒素血症发生时多种脂多糖(LPS)相关蛋白在LPS转运及活化中的调节作用。方法:培养佛波醇酯(PMA)诱导分化的THP-1细胞。选取LPS、脂多糖结合蛋白(LBP)、可溶性CD14(sCD14)、杀菌/渗透增强蛋白(BPI)、高密度脂蛋白(HDL)5因素2水平采用L16(215)正交设计。配制实验体系,培养4 h后,留取上清液,发光法检测TNF-α分泌量。结果:混合体系中,BPI和HDL存在负向效应,LBP、LPS和sCD14存在正向调节效应。TNF-α分泌量与sCD14、BPI的单独主效应有关(P<0.05),并与LBP和sCD14、LBP和HDL、LPS和LBP的交互作用有关(P<0.05)。结论:在体内多种相关蛋白同时存在时,LPS对单核巨噬细胞的活化与sCD14、BPI的单独效应有关,并与LBP和sCD14、LBP和HDL、LPS和LBP交互作用有关。