基因重组核型多角体病毒AcMNPV-AaIT对甜菜夜蛾幼虫的毒力研究

研究了基因重组核型多角体病毒AcMNPV AaIT和野生型多角体病毒AcMNPV C6对甜菜夜蛾的病原性,并添加感染增效物质,研究其增效作用。结果表明:AcMNPV AaIT对甜菜夜蛾3、4龄幼虫的LD50分别为151、379PIB/头,比AcMNPV C6少39、906PIB/头;LT50分别比AcMNPV C6缩短1.1d和1.5d;昆虫病毒感染增效物质具有强烈的感染增效作用,增效比值为617倍。

荧光增白剂对重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的增效作用

以 β -半乳糖苷酶基因为标志基因的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体 (AcMNPV -hsp70 /lacZ)研究光增白剂对该病毒的增效作用及其作用方式 .通过病毒毒力的生物测定表明 :光增白剂FB - 2 8能提高甜菜夜蛾幼虫的死亡率 ,降低半致死浓度 ,缩短半致死时间 ;光增白剂的增效作用与感染虫龄有关 .此外 ,应用组织切片技术对中肠组织病理以及血淋巴细胞感染观察表明 :在幼虫的病毒接种物中添加合适浓度的荧光增白剂不会改变病毒在幼虫中肠组织中的感染部位 ,却可以提高幼虫对病毒的敏感性 ,产生更多的病灶 .图版 1图 4表 3参

利用柞蚕幼虫繁殖rApNPV的研究初报

利用重组柞蚕核型多角体病毒(RecombinantAntheraeapernyiNuclearPolyhedrosisVirus,rApNPV) ,研究了无包涵体重组病毒(含β-半乳糖苷酶基因)在柞蚕幼虫体内的繁殖情况。结果表明 :无包涵体的重组病毒能够在柞蚕幼虫体内正常繁殖并引起继发感染 ,经柞蚕幼虫繁殖的重组病毒粒子能够完成对柞蚕幼虫的再次创伤感染。重组病毒所携带的β-半乳糖苷酶基因经柞蚕幼虫繁殖后仍能在柞蚕幼虫体内获得高效表达 ,表达量达到经培养细胞繁殖的重组病毒在柞蚕幼虫体内的表达水平 ,说明在利用杆状病毒批量表达外源蛋白时 。

利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子-1的研究

目的利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的可溶性分泌型重组人胰岛素样生长因子 1(rhIGF 1)。方法将 15kD人IGF 1(hIGF 1)前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)转移载体pBak PAK8中 ,经与野生型病毒DNA共转染家蚕细胞后 ,通过体内同源重组的方式获得重组病毒BmNPV/IGF 1。以Bm NPV/IGF 1感染 5龄家蚕幼虫 ,分别在感染后 2 4、48、72、96、10 8、12 0h提取家蚕血淋巴液 ,以ELISA法测定不同时象家蚕血中IGF 1浓度 ,采用Western blot分析鉴定IGF 1免疫学活性 ,MTT法观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。结果ELISA测定显示 ,BmNPV/IGF 1感染家蚕幼虫后 ,72h起蚕血中IGF 1浓度随感染时间延长而逐渐增高 (19.0 9～ 2 3.36 μg/ml) ,12 0hIGF 1含量达到最高值 (2 3 .36 μg/ml) ,Western blot分析发现表达产物在蚕体内被加工成 7.5kD成熟hIGF 1,并对NIH3T3细胞具有良好促增殖效应 ,其促细胞增殖能力明显优于来源于E .coli的IGF 1标准品。结论具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF

杆状病毒的垂直传播及绿色荧光蛋白在棉铃虫幼虫中的表达

用转座 /穿梭系统构建了携带绿色荧光蛋白基因 (gfp)的重组棉铃虫核型多角体病毒rHa FGP ,以其多角体添食感染棉铃虫 3龄幼虫 ,室内饲养 3代 ,各代均可见自然光下发绿色荧光的棉铃虫幼虫 ,其中子代不再重复感染。F0 、F1、F2 代发绿色荧光的棉铃虫幼虫所占百分比分别为34%、 2 0 %、 8%。提取虫体内的病毒多角体DNA ,以PCR和斑点杂交鉴定表明 ,gfp不仅在亲代棉铃虫体内正常表达 ,而且在子代幼虫中表达 ,HaNPV通过卵实现了垂直传播。

利用杆状病毒载体高效表达人胰岛素样生长因子-1及其纯化的研究

目的 :利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的重组人胰岛素样生长因子 1(rhIGF 1)。方法 :将 15kDhIGF 1前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)转移载体pBakPAK8中 ,构建重组病毒BmNPV/IGF 1。用BmNPV/IGF 1感染家蚕幼虫 ,提取家蚕血淋巴液 ,采用亲和层析法纯化rhIGF 1,ELISA法测定rhIGF 1含量 ,用SDS PAGE和Western blot分析鉴定rhIGF 1纯度及免疫学活性 ,MTT法观察其对MCF 7细胞增殖的影响。结果 :ELISA测定显示 ,BmNPV/IGF 1感染家蚕幼虫 12 0hrhIGF 1含量达最高值 ( 2 3 36 μg/ml)。rhIGF 1纯度为 4 0 % ,Western blot分析发现主要纯化产物为 7 5kD成熟hIGF 1。细胞活性刺激实验显示 ,纯化后rhIGF 1对MCF 7细胞促增殖能力明显优于来源于大肠杆菌的rhIGF 1产品。结论 :实现了具有免疫学活性及生物学活性rhIGF 1在杆状病毒表达系统的高效表达 ,并使rhIGF

家蚕丝素重链启动子克隆片段在家蚕体内和昆虫培养细胞内的渗漏表达

为了探讨家蚕丝素重链基因的调控机制,应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,研究了丝素重链基因启动子克隆片段在家蚕丝腺的不同部位,以及脂肪体细胞和Sf9培养细胞中的表达渗漏。结果发现,丝素重链启动子克隆片段在家蚕中部丝腺存在表达渗漏,并且在中部丝腺前部的表达活性要强于中部丝腺的中部和后部；克隆片段在脂肪体组织存在表达渗漏,通过荧光解剖显微镜可以在体表观察到绿色荧光；克隆片段在Sf9培养细胞中也存在表达渗漏。上述结果说明目前已知的有关家蚕丝素重链基因的调控元件仍不充分,家蚕基因组中可能还有其他调控丝素重链基因表达组织和时相的特异性元件存在。

零背景转座技术高效构建重组家蚕杆状病毒表达系统

【目的】获得零转座背景的基于家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)Bac-to-Bac系统,为高效经济构建重组BmNPV在家蚕体内表达目标蛋白提供新系统。【方法】利用R6Kγ作为复制子构建新的条件复制型杆状病毒转移载体pRADM,同时封闭BmNPV-Bacmid(Bm Bacmid)宿主菌(Escherichia coli BmDH10 Bac)的Tn7转座受体位点attTn7,获得新的封闭型宿主菌E.coli BmDH10 Bac△Tn7。【结果】由于pRADM无法在宿主菌E.coliBmDH10Bac中复制,封闭了attTn7位点的宿主菌也不能再和BmBacmid竞争与转移载体的重组,显著提高了转座效率。封闭宿主菌的attTn7位点,能使转座效率提高近4倍,使用条件复制型转座载体pRADM时,转座效率提高近10倍。而用pRADM转座E.coli BmDH10 Bac△Tn7时,转座阳性率为100%。避免了获得重组病毒DNA的鉴定程序,缩短了获得重组蛋白所需时间。用携带红色荧光蛋白基因DsRed的重组质粒pRADM-Red转座E.coli BmDH10 Bac△Tn7,获得重组BmBacmid转染BmN细胞,红色荧光蛋白在细胞中得到高效表达。【结论】结果表明pRADM和E.coli BmDH10 Bac△Tn7是一种零背景高效构建重组BmNPV的新系统。

荧光增白剂对杆状病毒病毒粒子与中肠上皮细胞融合的影响

解剖甜菜夜蛾幼虫中肠,dispase解离中肠上皮细胞,用分子探针R18标记病毒粒子囊膜,将标记的病毒粒子与离体中肠细胞混合后保温,病毒吸附2h后,加荧光增白剂,测定荧光强度的变化来测定病毒粒子与上皮细胞的融合,结果显示加有荧光增白剂实验组的荧光强度明显增高,荧光增白剂影响病毒与中肠上皮细胞的融合。