结缔组织生长因子全长及其缺失突变体重组腺病毒的构建和鉴定

目的:结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)含有4个不同功能结构域,构建表达带有3×Flag标签的全长基因及5个缺失突变体的重组腺病毒,以研究CTGF各结构域的功能和作用机制。方法:通过聚合酶链反应(Polymerasechain reaction,PCR)等克隆方法制备目标质粒DNA,然后通过腺病毒穿梭载体与骨架载体的重组、包装构建全长CTGF和缺失突变体重组腺病毒。用anti-Flag抗体作为一抗做Western blot检测目的基因表达情况。结果:通过腺病毒基因组DNA PCR确认有CTGF全长和缺失突变体的存在;Western blot法验证了CTGF全长和缺失突变体的表达。结论:成功构建了6个表达CTGF全长和缺失突变体的重组腺病毒,为进一步研究CTGF的结构域功能奠定了基础。

重组腺病毒低氧诱导因子1α三突变体基因对兔缺血后肢血流灌注及血管渗透性的影响

目的研究重组腺病毒低氧诱导因子1α三突变体基因(Ad-HIF-1α-trip)对兔缺血后肢血管渗透性的影响。方法 18只新西兰大白兔建立左侧后肢急性缺血模型,随机分成3组,分别为生理盐水组、腺病毒空载体组(Ad-Null组)、Ad-HIF-1α-trip组,每组6只,分别在术后即刻肌注生理盐水、Ad-Null及Ad-HIF-1α-trip。在术后即刻及基因转染后7、14和28 d进行血管超声检查。术后7 d、14 d和28 d通过血管超声计算缺血侧髂内动脉血流量标化值,评价兔缺血后肢血流灌注改善情况。基因转染后28 d采用伊文思蓝(EB)染色法测定各组缺血肌肉组织中EB含量,评价Ad-HIF-1α-trip对缺血组织新生血管渗透性的影响。结果 Ad-HIF-1α-trip组缺血侧髂内动脉血流量标化值增加大于其他2组,差异有统计学意义(P<0.05);Ad-HIF-1α-trip组缺血肌肉组织的EB含量略高于Ad-Null组及生理盐水组,但组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Ad-HIF-1α-trip能有效改善缺血肌肉组织的血流灌注,同时并未明显增加新生血管的渗透性。

BCR-ABL SH3-T79Y突变体重组腺病毒载体的构建及促进白血病K562/G01细胞凋亡

目的探讨构建BCR-ABL SH3-T79Y突变体(简称SH3-T79Y突变体)的重组腺病毒载体及其对白血病耐药细胞株K562/G01细胞凋亡的影响。方法以p Mig210质粒为模板,用重叠延伸PCR扩增SH3-T79Y突变体片段,将其克隆入重组腺病毒载体,通过鉴定、包装、扩增后得到含SH3-T79Y突变体的重组腺病毒。将重组腺病毒感染白血病K562/G01细胞株,测定其感染效率,瑞氏染色检查细胞形态学,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测BCR-ABL、Crk L磷酸化及总蛋白水平。结果重组腺病毒载体构建成功。SH3-T79Y突变体转染K562/G01细胞株72 h效率大于80%,可见明显的凋亡小体、核聚集等凋亡现象,凋亡率为32.46%,较对照组显著增加(P<0.05);明显抑制BCR-ABL和Crk L的磷酸化水平,降低BCR-ABL总蛋白表达(P<0.05)。结论成功构建SH3-T79Y突变体重组腺病毒载体,并证实其通过抑制BCR-ABL及底物Crk L磷酸化水平促进K562/G01细胞凋亡。

产肠毒素大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体的构建及表达

为构建产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体Ad STa-K99,通过PCR技术分别克隆了STa及K99基因,并与腺病毒穿梭质粒连接构建了穿梭质粒pAd5 STa-K99,将pAd5STa-K99和骨架质粒(含GFP基因)分别用PacⅠ酶切线性化,利用LipofectamineTM LTX&PLUS共转染293细胞进行同源重组包装重组腺病毒,通过PCR及Western blot对重组腺病毒进行鉴定。结果显示,重组腺病毒Ad5STa-K99构建正确并表达融合蛋白,且表达的融合蛋白能够被抗体所识别,为研制由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定了基础。

大肠杆菌热不稳定肠毒素无毒突变体LTR72基因重组质粒的构建

用PCR方法扩增大肠杆菌LT基因 ,将LT基因重组入pET32a质粒载体 ,对构建的重组质粒pET LT进行酶切、核苷酸序列分析 ,结果表明 ,插入片段LT的核苷酸序列与预期一致 ,且阅读框正确。并在影响LT毒性的关键氨基酸位点 ,用PCR方法引入点突变 (丙氨酸→精氨酸 ) ,成功构建了含有LTR72突变体基因的重组质粒pET LTR72。

重组腺病毒介导的人尿激酶原突变体在山羊乳汁中的表达

构建携带人尿激酶原突变体cDNA的重组腺病毒,通过该腺病毒介导实现外源基因在山羊乳腺中表达。通过大肠杆菌内同源重组将人尿激酶原突变体cDNA插入到腺病毒载体中,经过293细胞包装获得重组腺病毒,直接注射到泌乳山羊乳腺,收集感染后1～4天的乳汁,利用纤维蛋白溶圈试验、Western blot、ELISA检测乳清中尿激酶原突变体的表达。结果显示病毒注射后1～4天乳清中均可检测到尿激酶原的表达,其表达量可达0.41mg/ml。该方法可以实现重组蛋白在山羊乳腺的短期表达,可能是大规模生产临床医疗蛋白的一条经济有效的途径。

重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N的表达、纯化及生物学活性的研究

目的表达、纯化重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白D9N(rSEB-D9N),了解表达产物rSEB-D9N的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和肿瘤生长抑制作用。方法不同浓度IPTG诱导SEB-D9N突变体原核表达系统pET32a-SEB-D9N-E.coliBL21DE3表达rSEB-D9N,经Ni-NTA亲和层析法纯化rSEB-D9N,10%SDS-PAGE和高效液相色谱检测其纯度。以Vero细胞为靶细胞,进行rSEB-D9N的细胞毒性作用,并计算TCID50值。采用MTT法分别检测不同浓度的rSEB-D9N促人淋巴细胞增殖及抑制KB及MCF-7癌细胞株生长的作用。流式细胞术检测rSEB-D9N刺激人淋巴细胞后CD3、CD4、CD8的表达。结果rSEB-D9N表达产量约占细菌总蛋白30%,纯化后获得纯度为90.48%的rSEB-D9N。rSEB和rSEB-D9N对Vero细胞的TCID50值分别为3.12,8.85μg,10.0,20.0mg·L-1的rSEB-D9N具有显著的促PBMC增殖的作用(P<0.05),且主要上调CD3,CD4和CD8的表达。5.0～20.0mg·L-1rSEB-D9N作用的PBMC上清对KB和MCF-7细胞生长均可产生明显抑制作用(P<0.05)。结论获得并纯化了重组葡萄球菌肠毒素B突变体蛋白(rSEB-D9N),其细胞毒性作用有所降低,但促人淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用仍较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤相关药物的候选突变体。

重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的表达

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因通过重组腺病毒介导转染入B16黑素瘤细胞中的表达情况。方法用RT-PCR和流式细胞仪检测SEA基因在B16黑素瘤细胞中的表达。结果在转染SEA基因的B16黑素瘤细胞中检测到SEA基因的转录,并于转染后24h开始有SEA蛋白的表达,到72h表达量达最高值87.22,之后减弱,直到168h仍有少许表达。结论SEA基因可以在B16黑素瘤细胞中表达,为下一步黑素瘤的基因治疗奠定基础。

重组葡萄球菌肠毒素A及其突变体蛋白促淋巴细胞增殖作用的研究

目的观察重组葡萄球菌肠毒素A(rSEA)及其突变体蛋白对淋巴细胞增殖、活化作用及对淋巴细胞亚群分群的影响。方法分离健康人外周血单个核细胞(PBMC)及小鼠脾淋巴细胞悬液,体外经rSEA及其3种突变体(rSEA/H187A、rSEA/H225A和rSEA/D227A)蛋白刺激后,采用噻唑蓝法(MTT)检测人和小鼠脾淋巴细胞增殖水平,采用流式细胞术检测人外周血中T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+T细胞)及活化CD4+、CD8+T细胞和自然杀伤细胞(NK)的含量。结果 5～20 mg.L-1的rSEA及其3个突变体蛋白对人PBMC和小鼠脾淋巴细胞均有明显促增殖作用(P<0.05);经rSEA、rSEA/H225A刺激后的人PBMC中,CD3+、CD4+、CD8+T细胞的含量明显高于对照组,rSEA/H187A能上调CD3+和CD8+T细胞,而rSEA/D227A只上调CD8+T细胞(P<0.05);rSEA及3种突变体蛋白均能上调活化CD4+和CD8+T细胞,rSEA、rSEA/H187A、rSEA/H225A能上调NK细胞含量(P<0.05)。结论 rSEA及其3种突变体(rSEA/H187A、rSEA/H225A和rSEA/D227A)蛋白对淋巴细胞均有明显促增殖和活化作用,并可不同程度地上调T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及NK细胞的含量,为筛选出低毒、高效的升白细胞相关药物候选突变体奠定基础。

疫苗

902122 破伤风毒素片段 C 在大肠杆菌中的表达:它的提纯和用作疫苗的可能性[英]/Makoff,A.J.…//Bio/Technol.-1989,7(10).-1043～1046[译自 DBA,1989,8(25),89-14933]破伤风毒索的木瓜蛋白酶切割产物片段 C 是一种50kDa 的非毒性多肽。

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在C57BL/6小鼠淋巴细胞中的表达

目的通过复制缺陷型腺病毒载体的介导,将金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染入C57BL/6小鼠淋巴细胞中,观察基因表达产物对B16细胞的作用。方法通过MTT法直接测定重组腺病毒颗粒感染的淋巴细胞的增殖情况,采用双抗体夹心ABC-ELISA法,测定淋巴细胞培养上清液中白介素2的水平。MTT法测定活细胞数目,以了解活化的C57BL/6小鼠淋巴细胞对B16细胞的杀伤效应。结果加入不同滴度的重组腺病毒颗粒后,C57BL/6小鼠淋巴细胞明显增殖;同时淋巴细胞培养上清液中白介素2水平也明显增加。重组腺病毒颗粒转染的C57BL/6小鼠淋巴细胞可明显杀伤B16细胞,效/靶比越高,杀伤效应越明显。结论SEA基因可以在C57BL/6小鼠淋巴细胞中表达,并且表达产物能够活化C57BL/6小鼠淋巴细胞,进而杀伤B16细胞。