重组水蛭素Ⅲ的分离纯化与鉴定

目的 :从分泌型重组水蛭素 Ⅲ 基因工程菌发酵液中分离纯化水蛭素 Ⅲ。 方法 :将发酵液经离心、大孔吸附树脂处理后 ,用DEAE- celluloseDE5 2离子交换层析 ,进而用HPLC反相层析。结果 :总收率达 5 0 %以上 ,纯度达 99.9% ,比活力达 90 0 0ATU/mg。结论 :分离纯化系统令人满意 ,回收率较高。

重组水蛭素Ⅲ口服制剂给药系统的初步研究

目的探讨重组水蛭素Ⅲ(以下简称rHV3)的口服制剂。方法采用在体原位肠袢法研究小肠和结肠在吸收促进剂作用下对rHV3的吸收情况,寻找促进rHV3肠道吸收的吸收促进剂和吸收位置;合成蛋白酶抑制剂——壳聚糖-EDTA轭合物(chitosan-EDTAconjugates,CEC),考察rHV3在胃蛋白酶和胰蛋白酶中的稳定性;将rHV3和促吸收剂、CEC乳化,考察其抗凝血作用。结果吸收促进剂能提高rHV3在肠道内的吸收水平,其中在0.5%EDTA-Na2的作用下rHV3经由小肠给药产生的抗凝血作用最强;CEC在消化酶的存在下对rHV3有保护作用;乳化微粒与单用rHV3的抗凝血作用有显著性差异。结论重组水蛭素Ⅲ和促吸收剂以及CEC形成的乳化微粒经灌胃能够发挥其抗凝血作用。

重组水蛭素Ⅲ分子改建及其构效关系的初步研究

采用一种新的PCR定点诱变技术成功地对野生型水蛭素Ⅲ进行了定点诱变 ,这种方法快速、简便 ,有效。通过突变 ,将野生型水蛭素Ⅲ分子的活性功能非必需区的指状结构顶端第 33～36位的氨基酸残基替换为RGDS序列 ,并进行了高效分泌表达 ,表达产物分泌到细胞外发酵液中。改构的水蛭素突变体与野生型水蛭素Ⅲ相比 ,两者的抗凝血酶活性基本一致 ,但体外抗血小板凝集试验结果表明 ,前者除原有的抗凝活性外还具有显著的抗ADP诱导的血小板凝集活性 ,该研究为水蛭素Ⅲ分子的结构功能关系研究以及新型抗凝药物的研制打下了基础。

分离纯化重组水蛭素Ⅲ工艺的优化研究及重组水蛭素Ⅲ的分子鉴定(英文)

目的优化分离纯化大肠杆菌发酵液中重组水蛭素Ⅲ的工艺并对所纯化产物进行分子鉴定。方法通过三步纯化步骤,即大孔树脂层析、DEAE纤维素DE52层析和反相高效液相色谱层析,分离纯化发酵液中的重组水蛭素Ⅲ,优化纯化条件。通过SDSPAGE和分析型反相高效液相色谱对重组水蛭素Ⅲ的纯度进行鉴定。以质谱对重组水蛭素Ⅲ的分子量进行鉴定。通过肽图的测定来鉴定重组水蛭素Ⅲ的结构。结果通过优化后的分离纯化步骤得到了纯度为95.4786%的纯品,总产率为39%。得到的产物分子量为6913.32±6.55Da,与重组水蛭素Ⅲ分子量的理论值相符,其结构亦与理论值一致。结论优化后的分离纯化步骤可以有效地用于大肠杆菌发酵液中重组水蛭素Ⅲ的大规模分离纯化。所得的高纯度产物确为基因重组水蛭素Ⅲ。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响

背景重组水蛭素Ⅲ（rHV3）对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞（LECs）有较好的保护作用，但其分子机制尚不清楚。目的探讨rHV3对半乳糖损伤的人LECs凋亡相关基因表达的影响。方法用本课题组构建的表达重组水蛭素工程菌，参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行水蛭素生物学活性的测定。将培养的人LECs分为3组，培养于含质量分数10％胎牛血清（FBS）的D／F12培养液作为正常组、用含125×10^-3mol／LD一半乳糖的D／F12培养液建立人LECs株SRAOI／04损伤模型为模型组，用2000U／ml（商品单位）rHV3加入部分损伤模型培养液中进行干预作为rHV3组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组人LECs内凋亡相关基因的表达，包括醛糖还原酶（AR）、bcl2、bax、p53基因mRNA的表达水平，各目的基因表达丰度用目的基因的吸光度（A）值与3一磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）A值的比值表达。结果与正常组比较，模型组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显高于对照组，差异均有统计学意义（t=3．90E一06、t=8．44E一04、t=5．15E一08，P〈0．叭），而水蛭素干预组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显低于模型组，差异均有统计学意义（t=5．90E一06、t=1．51E．04、t=3．42E一06，P〈0．01）。与正常组比较，模型组人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值明显降低，差异有统计学意义（t=1．86E一05，P〈O．01），与模型组相比，水蛭素干预后人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值显著提高，差异有统计学意义（t=8．56E一05，P〈0．01）。结论D一半乳糖导致人LECs损伤，rHV3可能通过抑制多元醇途径和线粒体介导的凋亡途径对人LECs起保护作用。

重组水蛭素Ⅲ的中试工艺研究

从大肠杆菌中大规模纯化重组水蛭素Ⅲ,进行重组水蛭素Ⅲ中试发酵工艺和纯化中试工艺研究,连续大量纯化3批,并对纯化终产品进行鉴定。通过菌种活化,一级、二级种子液制备,30L发酵罐补料-批式发酵水蛭素产量达到6000ATU/ml,发酵液经还原性SDS-PAGE分析表明在14000u处有单一条带,为重组水蛭素Ⅲ二聚体。经大孔树脂层析、DEAE-纤维素层析、制备型反相高效液相层析等3步纯化后重组水蛭素Ⅲ的比活达8270ATU/mg。经分析型反相高效液相色谱分析,纯度达95%以上,总收率达到39%以上。通过实验建立了稳定的发酵和纯化工艺流程。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用

为研究重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用,采用D-半乳糖建立人晶状体上皮细胞损伤模型,用重组水蛭素Ⅲ作用于受损细胞,设置正常组、模型组、低、中和高剂量重组水蛭素Ⅲ组以及阳性药白内停组,观察各组细胞密度和形态,用MTT法检测各组细胞存活率,考察各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果表明,当D-半乳糖浓度为50×10-3mol/L时,模型组与正常组细胞有显著差异。重组水蛭素Ⅲ作用后受损细胞的存活率和SOD活性显著提高。因此,重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞有明显的保护作用。

大肠杆菌分泌表达重组水蛭素Ⅲ的新方法研究

目的:在已有的分泌表达载体pTASH基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体,并检验其分泌表达水平是否提高。方法:提取原始质粒pTASH作为模板,用PCR扩增重组水蛭素基因表达盒片段以后,再插入到原表达载体pTASH的BamHⅠ位点上,从而产生含有两个串联的水蛭素基因表达盒单元的质粒p(TASH)2,转入大肠杆菌进行摇瓶表达。结果:双表达盒菌种p(TASH)2进行摇瓶水平的培养,其上清液抗凝血酶活性可达3 500 ATU.ml-1。结论:与单表达盒质粒pTASH的表达水平(2 000 ATU.ml-1)相比,双表达盒质粒p(TASH)2的摇瓶表达水平显著提高。

冻干重组水蛭素Ⅲ的稳定性研究

目的研究冻干重组水蛭素Ⅲ的稳定性,为选择包装材料、确定贮藏条件和有效期提供依据。方法通过影响因素实验,加速实验和长期稳定性实验,对其外观性状、溶解性、干燥失重、活性等进行研究。结果该制剂的主要影响因素是湿度和温度,光照影响不大;加速试验条件下6个月时活力能保持80%左右,其他指标正常;长期稳定性试验条件下,放置12个月后,各项指标均符合质量标准。结论该制剂可在室温下稳定保存12个月。

基于3A组装的多拷贝基因策略优化重组水蛭素变体Ⅲ的生产

水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表达重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ,Rhv3)的办法。首先,在C.glutamicum中构建含Ptac启动子和CspA信号肽的Rhv3分泌表达菌株,比较其在不同培养基中的表达情况。结果表明在BHI培养基中Rhv3活性最高,达到3.02×10^(3) ATU/L。为进一步提升Rhv3产量,通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)筛选,选用RBS1应用于Rhv3多拷贝菌株构建和表达。然后利用3A组装技术构建含不同信号肽和不同拷贝数的Rhv3分泌表达菌株进一步优化其产量。通过放大发酵培养,Rhv3产量达到1.89 g/L,活性达到10.91×10^(3) ATU/L。最后利用镍柱对Rhv3进行简单纯化,其纯度达到90%。该异源表达策略有效提高Rhv3表达量,为Rhv3的重组生产提供了一种质量可靠、低成本的表达体系。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞热应激蛋白表达的影响

探讨重组水蛭素Ⅲ(rHV3)对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞(hLEC)热应激蛋白(Hsp)表达的影响。采用125×10-3mol/LD-半乳糖建立人晶状体上皮细胞SAR01/04损伤模型,用重组水蛭素Ⅲ干预受损细胞,设置正常组、模型组、和重组水蛭素Ⅲ组,用倒置显微镜观察各组细胞密度和形态,RT-PCR检测人晶状体上皮细胞内3种热应激蛋白mRNA的表达。结果显示,125×10-3mol/LD-半乳糖导致人晶状体上皮细胞显著损伤,3种热应激蛋白,即Hsp70、Hsp27和αB-晶体蛋白的mRNA表达显著上调。重组水蛭素Ⅲ的干预使细胞形态趋于正常,细胞内Hsp70、Hsp27和αB晶体蛋白的mRNA表达显著下调。因此,重组水蛭素Ⅲ能有效缓解高浓度半乳糖导致的热应激蛋白应激耐受,从而保护晶状体上皮细胞。

重组水蛭素Ⅲ乳化微粒口服的药效学

目的探讨重组水蛭素Ⅲ乳化微粒(rHVⅢEP)口服的抗凝血、抗血栓作用。方法①将SD大鼠随机分为4组,分别为水蛭素大、小剂量组(65,130U·g-1),华法林钠阳性对照组和生理盐水组。分别于给药前、后1h各取血1.5～2mL,测定凝血时间(CT)、血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶凝固时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT);②采用大鼠弥散性血管内凝血模型,测定PT、TT、APTT;③动物分组如上,采用大鼠下腔静脉血栓模型,测定血栓湿重和干重,计算血栓抑制率;④动物分组如上,采用大鼠颈动静脉回路形成的血小板性动脉血栓模型,测定血栓湿重,计算血栓抑制率。结果①rHVⅢEP能延长CT、PT、TT、APTT,与空白对照组有显著差异(P<0.05或P<0.01);②rHVⅢEP能延长大鼠弥散性血管内凝血模型PT、TT、APTT,并与生理盐水组有显著差异;③rHVⅢEP口服可使大鼠下腔静脉血栓湿重、干重明显减少,血栓抑制率显著升高,与生理盐水组有显著差异;④rHVⅢEP口服可使大鼠颈动静脉回路形成的血小板性动脉血栓重量明显减少,显著升高血栓形成抑制率,与生理盐水组有显著差异。结论rHVⅢEP口服抗凝血、抗血栓作用显著,可用于防治实验性大鼠弥散性血管内凝血、大鼠颈动静脉回路形成的血小板性动脉血栓和大鼠下腔静脉血栓,具有良好的应用前景。

重组水蛭素Ⅲ乳糜微粒抗凝血抗血栓作用的研究及其口服吸收机制初探(英文)

目的:对重组水蛭素rHⅧ乳糜微粒(rHⅧ EP)的抗血栓及抗凝效果进行了药效学评价并对其口服给药的吸收机制进行了初步探索。方法:分别采用正常大鼠, 弥散性血管内凝血(DIC)模型大鼠及下腔静脉凝血(IVC)模型大鼠测定rHⅧ乳糜微粒的药效; 将rHⅧ以异硫氰酸荧光黄(FITC)标记后通过Caco-2 单细胞模型和肠外翻模型测定乳糜微粒的初步吸收动力学。结果:体内实验中, rHⅧ EP可延长凝血酶时间(TT), 凝血时间(CT), 并抑制血栓的形成。转运实验证明, rHⅧ在肠的各个部位均有吸收, AP面向BL面的转运速率Papp为(2.68 ± 0.14) ×10-6 cm·s-1, BL到AP的Papp值为(3.02 ± 0.66) ×10-6 cm·s-1, 提示其在肠内的运输方式主要为被动运输。相较于静脉注射方式, rHⅧ乳糜微粒的口服绝对生物利用度为 11.42%。结论:rHⅧ EP具有抗血栓和抗凝作用以及适合的生物利用度。在此基础上, 作者首次提出将rHⅧ制成口服给药的乳糜微粒形式存在良好的开发潜力。

重组水蛭素Ⅲ滴眼液的组织分布和排泄研究

为了研究重组水蛭素Ⅲ(recombinant hirudin Ⅲ,rHVⅢ)滴眼剂在新西兰兔中的组织分布和粪尿排泄,用氯胺-T法将放射性同位素125I标记到rHVⅢ的酪氨酸残基上,通过同位素示踪方法考察滴眼给药后125I-rHVⅢ在新西兰兔体内的组织分布和粪尿排泄。结果发现新西兰兔滴眼给予125I-rHVⅢ后,125I-rHVⅢ主要通过肾脏排出,给药后120 h通过尿液排出放射性活度占总放射性活度的(81.54±10.78)%,同时通过粪便排出的放射性活度仅为(6.20±2.05)%。将放射性活度高的尿液,经RP-HPLC分离,实验结果表明尿液中存在重组水蛭素Ⅲ原型且比例达23.52%以上。组织分布实验结果表明,rHVⅢ原型及其代谢物在肾脏、血浆分布最多,脑中几乎无分布;rHVⅢ原型及其代谢物在眼部主要分布在角膜及巩膜,房水也有分布,而玻璃体和晶状体几乎没有分布。因此,rHVⅢ主要通过肾脏代谢并以原型和代谢物的形式通过尿液排出体外。

重组水蛭素Ⅲ口服乳糜微粒的研究

为了实现重组水蛭素Ⅲ口服给药途径并验证其药效,将其制成乳糜微粒,比较了3种制备方法,确定了逆相蒸发法为r HV3乳糜微粒的最佳制备方法。优化了制备条件,通过正交实验确定了r HV3乳糜微粒配方,制得的r HV3乳糜微粒的包封率为(65.08±1.96)%。在-20℃保存条件下r HV3乳糜微粒稳定性良好。药效学实验结果表明,口服r HV3乳糜微粒具有良好的抗凝和抗栓作用。

重组水蛭素Ⅲ多克隆抗体的制备

目的:制备重组水蛭素Ⅲ(rHV3)多克隆抗体。方法:分别用戊二醛法与碳二亚胺法处理抗原,电泳检测rHV3自身交联及与牛血清白蛋白(BSA)交联结果;分别免疫家兔、豚鼠和大鼠后取血清,双向免疫扩散试验测定效价。结果:rHV3交联BSA后作为抗原免疫豚鼠和家兔产生了抗体,抗体效价1∶16。结论:rHV3交联BSA作为rHV3抗原免疫家兔、豚鼠可以产生rHV3多克隆抗体。