重组海参溶菌酶N端可溶性表达与抑菌分析

通过对海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)cDNA(Genbank accession no:EF036468)片段的分析,结果发现N端基因区域所对应的蛋白质序列中含有糖苷酶活性。因此利用RT-PCR技术以其为模板,扩增出长度为174 bp的溶菌酶N端(SjLys-N)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-N,再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组SjLys-N的基因工程菌。该工程菌在改造的LB培养基和最适的发酵条件下经IPTG诱导后,表达约23 kD的重组SjLys-N蛋白。此外,它还能以可溶性的形式表达,占总菌体蛋白约46%。经过Western blotting分析,重组SjLys-N在23 kD左右能够与penta-his抗体发生特异性免疫反应,结果表明重组SjLys-N得到正确的表达。最后对纯化后的重组SjLys-N进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌和副溶血弧菌有较高的抑菌活性。上述结果将为进一步研究海参溶菌酶的基因结构与功能之间的关系提高参考。

重组海参溶菌酶理化特性及生物活性的初步研究

将构建好的重组海参溶菌酶毕赤酵母菌株进行诱导表达，用CM52-纤维素阳离子交换柱分离得到电泳纯的重组海参溶菌酶。利用浊度法测定该酶的活性，滤纸片液体扩散法测定其抑菌谱。结果显示，重组海参溶菌酶的最适pH值为6．5，最适温度为35℃，在pH5．0～7．5、50qC以下有较好的稳定性。抑菌谱测定结果显示重组海参溶菌酶对6种指示菌均表现出抑菌性，尤其对副溶血弧菌的抑制作用最强。上述结果均与天然海参溶菌酶一致。