重组溶瘤2型单纯疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立与验证

目的为了建立高效、敏感的针对重组溶瘤2型单纯疱疹病毒(oHSV2)的荧光定量PCR方法。方法依据oHSV2的基因序列,登录Beacon Designer 8.0软件设计引物,提取前期已重组好的阳性质粒pHG52d34.5CMVhGM-CSF,测定浓度并换算后梯度稀释为荧光定量PCR的模板,进行PCR反应。结果经过多次调整实验的反应条件和反应体系,熔解曲线为单一峰,该病毒与野生型Ⅰ型单纯疱疹病毒、野生型Ⅱ型单纯疱疹病毒等没有交叉反应。oHSV2最低检测限为1000 copies/μL,R^2可达0.997,批内及批间变异系数分别为0.357%~1.156%和1.06%~3.35%,体液(血液)中预加的oHSV2的回收率为96.6%~109.3%。结论成功建立了oHSV2的SYBR Green实时荧光定量PCR方法,可特异而灵敏地检测血浆中的oHSV2。

Ⅰ型单纯疱疹病毒溶瘤药物的研究进展

Ⅰ型单纯疱疹病毒作为载体具有宿主范围广、感染效率高和可携带大片段外源基因等优势,将其改造为溶瘤病毒治疗恶性肿瘤是当前国内外研究人员的研究重点。本文就I型单纯疱疹病毒溶瘤药物的相关研究进展作一综述。

女性人乳头状瘤病毒与单纯疱疹病毒Ⅱ型感染的相关性研究

目的探讨女性生殖道人乳头状瘤病毒(HPV)与单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)感染的相关性。方法对427例女性宫颈脱落细胞标本采用PCR-反向点杂交进行HPV-DNA分型检测,将其中的49例HPV阳性标本作为HPV阳性组,同时随机选取40例HPV阴性标本组作为对照组,再利用实时荧光PCR同时检测上述两组病例的HSV-Ⅱ感染情况。结果 HPV阳性组及HPV阴性组的HSV-Ⅱ阳性率分别为20.4%(10/49)和7.5%(3/40),HPV和HSV-Ⅱ的感染有显著的相关性(P<0.05)。结论女性生殖道HPV与HSV-Ⅱ感染具有协同作用并密切相关,早发现、早治疗对于预防宫颈癌具有十分重要的意义。

单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的免疫研究

目的 构建新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗 ,鉴定其在哺乳细胞中的表达 ,检测其激发动物产生免疫反应的能力。方法 RT -PCR鉴定gD基因在COS - 7细胞中的表达 ,ELISA检测血清中中和抗体水平 ,用病毒攻击后检测其保护效率。结果 pVAX -gD能在COS- 7细胞中表达 ,并可激发免疫动物产生高滴度中和抗体 ,有效保护动物免受致死量病毒的攻击。

1型单纯疱疹病毒突变体治疗肿瘤的研究进展

病毒溶瘤治疗的研究由来已久,但治疗多种人类恶性肿瘤的溶瘤病毒的选择构建仍在不断的探索与研究中。目前1型单纯疱疹病毒(HSV-1)被认为是最为有效的溶瘤病毒。作者阐述了溶瘤病毒治疗肿瘤的现状及研究机制、HSV-1的生物学特点、HSV-1突变体构建及其治疗肿瘤的现状,并探讨了放射性核素标记HSV-1突变体的可行性及标记物治疗肿瘤的前瞻性。

重组溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒生产技术规范

主要起草人陈媛、范九梅、方志正、高凯、胡文言、金燕京、刘滨磊、李少伟、刘琼、鲁惠萍、毛泽勇、饶春明、石晓太、夏南、余鹏威、朱涛、周斌起草单位武汉滨会生物科技股份有限公司、北京昭衍药物检定研究有限公司、康希诺生物股份公司、厦门大学前言本指南按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本标准适用于重组溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒的生产管理、质量控制及质量保证等活动。

单纯疱疹病毒II型CTL表位DNA疫苗的Th1/Th2免疫应答研究

目的探讨单纯疱疹病毒II型(HSV-2)CTL表位疫苗对小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响。方法用构建的HSV-2pVAX-gD-CTL重组质粒免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第4周检测小鼠血清中gDIgG水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中INF-γ,IL-4水平;流式细胞仪测定小鼠CD4+,CD8+T淋巴细胞亚群。结果HSV-2pVAX-gD-CTL疫苗免疫小鼠后可以诱导脾淋巴细胞增殖及分泌INF-γ和IL-4,诱导CD4+,CD8+T细胞百分比的升高;并能刺激血清HSV-2gD特异性抗体的产生。其中pVAX-gD-CTL组在脾淋巴细胞刺激指数及其分泌INF-γ水平、CD4+,CD8+T细胞百分比升高方面均显著高于pVAX-gD对照组。结论CTL表位对单纯疱疹II型重组DNA疫苗诱导的Th1型免疫应答有促进作用。

溶瘤单纯疱疹病毒激活PBMC抗肿瘤的初步机制

目的:研究重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒激活外周血单核细胞的初步机制,为后续研究中激活的免疫细胞杀伤肿瘤奠定基础。材料:健康志愿者血液样本,灭活oHSV2。方法:灭活的oHSV2与分离的免疫细胞进行共孵育,采用CCK-8试剂盒以及qPCR的试验方法,检测细胞的增殖以及γ干扰素的相对表达量。结果:刺激的后PBMC与阴性对照组相比较,MOI=0.01条件下的细胞增殖具有统计学极显著差异(P<0.001)。经过病毒刺激后的PBMC中γ干扰素的mRNA表达量增高。

单纯疱疹病毒Ⅰ型最新研究进展——病原学、防控及应用

单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus 1,HSV-1)感染可引起广泛的临床症状,包括口腔感染造成的组织损伤,以及严重的中枢神经系统感染造成的脑炎。HSV-1的研究每年都有突破性进展,其病原学、感染引致慢性炎症、抗病毒制剂,以及作为微生物工具用于治疗肿瘤的研究,引起了业界同行的广泛兴趣。本文对HSV-1近几年的研究进展进行综述,为进一步了解该病毒致病机理及应用价值提供参考。

首批1型单纯疱疹病毒溶瘤活性测定国家候选标准品的研制

目的:研制首批1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)溶瘤活性测定国家标准品。方法:按2020年版《中华人民共和国药典》三部相关要求,分别进行HSV-1溶瘤活性测定液体标准品和冻干标准品的制备和质量检测,并使用热加速试验进行稳定性考察,以U-2 OS细胞/CCK-8法分别在3家实验室对标准品的溶瘤活性进行协作标定。对比研究液体标准品和冻干标准品,选择其中更为适用的1种作为国家标准品。结果:制备的2种HSV-1溶瘤活性测定标准品的质量检测结果均符合要求,其中冻干标准品水分含量为1.09%,分装精度为0.15%。稳定性试验结果用阿伦尼乌斯公式计算,初步预测液体标准品溶瘤活性在-70℃下降低10%需7.7年;冻干标准品溶瘤活性在-70℃下降低10%需6.1×10^(5)年,其稳定性得到很大提高。3个实验室协作标定进行了共21次测定,液体标准品的溶瘤活性值几何均数为7.08×10^(4)U·mL^(-1),冻干标准品的溶瘤活性值几何均数为1.82×10^(4)U·支^(-1)。HSV-1标准品原液在冻干后溶瘤活性由7.08×10^(4)U·mL^(-1)下降至3.03×10^(4)U·mL^(-1),但因其溶瘤活性在预稀释100倍后仍然出现良好的S型量效关系曲线,并不影响它作为标准品使用的要求。将液体标准品作为样品,用冻干标准品作为标准品进行校准后,3家实验室结果的几何变异系数(GCV)由64.4%下降到29.2%,实验的精密度得到较大提高。结论:该批HSV-1溶瘤活性测定冻干标准品各项指标均符合相关要求,与液体标准品相比更适合作为国家标准品使用,其溶瘤活性赋值为1.82×10^(4)U·支^(-1)。

人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(OH2)生物学特性的稳定性

目的分析人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(oncolytic herpes simplex virus type 2,OH2)生物学特性的稳定性。方法将OH2在Vero细胞中连续传20代,测定不同时间点收获的不同代次(P4、P10、P20)病毒的滴度,并绘制病毒的生长曲线;ELISA夹心法检测表达的h GM-CSF的含量;TF-1细胞培养法检测表达的h GM-CSF的活性;CCK-8试剂盒检测OH2的体外癌细胞杀伤能力。结果 OH2在Vero细胞中连续传20代后,不同代次病毒(P4、P10、P20)的生长曲线模式、表达的h GM-CSF含量及活性、体外癌细胞的杀伤能力均无明显差异。结论 OH2生物学特性的稳定性良好,具有新生物药开发前景。

重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒纯化工艺的建立

目的建立重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simple virus typeⅡ,o HSV2)OH2纯化工艺,制备高纯度的病毒。方法采用不同粗滤材质[PDH4囊式过滤器、Bio20囊式过滤器、Ultipor GF U6-40、PP材质滤膜(聚丙烯膜)和CA材质滤膜(醋酸纤维膜)]澄清过滤后,使用不同的层析柱(Mustang Q、Sartobind Q囊式离子交换柱和Capto^(TM) Core 700)进行纯化,并根据确定的纯化工艺,进一步放大层析柱体积。依据病毒滴度的变化,选择合适的纯化工艺条件。结果 PP及CA材质滤膜过滤病毒液后滴度变化较小,二者对病毒吸附较低;Mustang Q、Sartobind Q囊式离子交换柱纯化OH2病毒时收率最高为13%,而Capto^(TM) Core 700在AKTA仪上纯化高滴度的病毒液时几乎不损失病毒;使用Capto^(TM) Core 700进行柱体积放大后,柱床直径为26 mm时,纯化后病毒的滴度及收率较理想。结论使用CA膜过滤细胞裂解液后,采用Capto^(TM) Core 700进行柱层析,可制备高纯度的OH2。

重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒人细胞巨噬细胞集落刺激因子的质量研究

目的研究建立重组复制型溶瘤单纯疱疹病毒人细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,HSV1/GM-CSF)的质控方法与质量标准。方法采用限制性内切酶酶切与PCR法,对GM-CSF基因、单纯疱疹病毒载体ICP 34.5、ICP6、ICP47等改造结构进行鉴定。采用A260紫外吸收法检测病毒颗粒数;pfu法测定HSV1/GM-CSF感染活性。HSV1/GM-CSF体外感染Vero细胞后,分别测定感染上清中GM-CSF表达量以及表达产物的生物学活性;测定HSV1/GM-CSF对肿瘤细胞MCF7的体外杀伤活性;HSV1/GM-CSF分别以相同MOI感染MCF7与二倍体人胚肺成纤维细胞MRC5后,分别测定细胞裂解上清中子代病毒的感染活性,并以子代病毒的感染活性比值来分析该制品在肿瘤细胞中的增殖复制能力。采用PCR法控制野生型单纯疱疹病毒等外源因子的残留。结果对重组HSV1/GM-CSG基因组的酶切、以及对所携带的GM-CSF基因、ICP 34.5、ICP6、ICP47基因改造区的PCR鉴定结果与理论值相符。病毒载体颗粒数为4.5×1010VP.mL-1,感染活性为4.3×107pfu.mL-1。HSV1/GM-CSF以MOI 0.01感染Vero细胞72 h后,ELISA检测上清中GM-CSF表达量为228 ng.mL-1,表达产物的生物学活为4.3×103U.mL-1。该基因治疗制剂对人乳腺癌肿瘤细胞MCF7体外杀伤的MOIIC50为0.08。以相同MOI感染并经pfu法检测,HSV1/GM-CSF在人乳腺癌肿瘤细胞MCF7与人胚肺成纤维二倍体细胞MRC5的增殖比值为308。未检出野生型单纯疱疹病毒。其他各项指标均符合《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及2005年版《中国药典》(三部)要求。结论初步建立了HSV1/GM-CSF的质控方法和质量标准,并已用于该制品的质量控制。

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子溶瘤2型单纯疱疹病毒注射液(Vero细胞)的药效学分析

目的分析重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)溶瘤2型单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simplex virus type 2,OH2)的体内、外药效。方法按不同感染复数(MOI)=0.002、0.01、0.05、0.25、1.25分别感染人结肠癌细胞(Lo Vo)和人喉癌细胞(Hep2),MTT法检测OH2在体外的溶瘤作用。经BALB/c-nu正常小鼠右侧肋腹皮下分别注射Lo Vo细胞和Hep2细胞,当肿瘤平均体积>100 mm^3时,试验组于肿瘤内分别注射高、中、低剂量的OH2(1×10~7、1×10~6、1×10~5 CCID_(50)/m L),同时设阳性对照组(5 mg/m L的5-FU)及阴性对照组(DMEM/F12培养基),于第0、3和6天进行注射。首次注射后第0、3、6、9、12、15、18天测量肿瘤长径(a)和宽径(b),计算肿瘤体积(tumor volume,TV)及相对肿瘤增殖率。结果 OH2在较小浓度下(MOI分别为0.168和0.063)即可较好地杀伤Lo Vo和Hep2细胞。与阴性对照组比较,两种肿瘤模型的OH2高、中、低剂量组及阳性对照组均有显著抑瘤效果(P<0.05);Lo Vo肿瘤模型中,OH2高剂量组的抑瘤效果明显优于中、低剂量组(P<0.05);Hep2肿瘤模型中,OH2高、中、低剂量组的抑瘤效果差异无统计学意义(P>0.05)。结论 OH2在体外和体内实验中均显示较好的溶瘤作用,具有新生物药开发前景,为临床前研究提供了实验依据。

人乳头状瘤病毒及单纯疱疹病毒Ⅱ型感染与宫颈疾病的相关性研究

目的研究人乳头状瘤病毒(HPV)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染与宫颈疾病的相关性,为临床资料提供参考依据。方法选择医院2012年3月-2013年3月不同宫颈疾病患者181例,均留取宫颈活检组织进行HPV高危型和HSV-2检测,对HPV高危型和HSV-2感染的相关性进行研究,分为慢性宫颈炎组62例、宫颈上皮内瘤样变组66例、宫颈癌组53例,3组数据采用SPSS13.0统计处理。结果慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变、宫颈癌患者HPV阳性率分别为1.61%、53.03%、96.23%,呈上升趋势,3种宫颈疾病患者HSV-2感染率分别为0.00%、1.51%、11.32%,宫颈癌患者HSV-2感染率明显高于慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变患者,宫颈癌患者HPV阳性率与慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变患者比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HPV高危型感染是宫颈癌发生的主要因素,合并HSV-2感染可能在致癌过程中具有协同作用,会导致癌变的危险性增加,因此,对性传播疾病患者进行宫颈癌筛查,对于宫颈癌的早期诊断与治疗具有一定的作用。

人乳头状瘤病毒16/18、单纯疱疹病毒Ⅱ型和巨细胞病毒感染与宫颈癌发生、发展的关系

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16/18、单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)和巨细胞病毒(CMV)感染与宫颈癌发生、发展的关系。方法对43例宫颈癌、47例宫颈上皮瘤样病变(CIN)、56例宫颈炎和10例正常宫颈进行聚合酶链反应检测HPV16/18、HSVⅡ和CMV感染情况。结果HSVⅡ、HPV16/18和CMV的阳性率在宫颈癌和CIN组、CINⅢ级和CINⅠ～Ⅱ级组均有递减趋势,且差异有统计学意义。Ⅱ期宫颈癌组HPV16/18阳性显著高于Ⅰ期宫颈癌组,高分化宫颈癌组HPV16/18和HSVⅡ阳性高于中分化组,与临床分期及组织类型差异均无统计学意义;CMV阳性与临床分期、组织分级及组织类型差异均无统计学意义。三种病毒感染拷贝数,HSVⅡ和HPV16/18:宫颈癌>CIN>宫颈炎;CMV:宫颈癌>CIN。宫颈癌中出现几种病毒混合感染,其中HPV16/18合并HSVⅡ明显多于HPV16/18合并CMV者。结论HPV16/18、HSVⅡ和CMV感染与宫颈癌的发生发展关系密切,且与病毒负荷量有关,可能是宫颈癌的致病因子。

人乳头瘤病毒、沙眼衣原体和单纯疱疹病毒Ⅱ型感染与宫颈疾病的相关性研究

目的探讨人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）、沙眼衣原体（chlamydia trachomarls，CT）和单纯疱疹病毒Ⅱ型（herpes simplex virus Ⅱ，HSV-Ⅱ）感染与宫颈疾病的关系。方法采用核酸分子快速杂交基因分型技术对598例宫颈脱落细胞进行HPV感染基因型分型测定，同时应用实时荧光定量PCR法（FQ—PCR）检测CT和HSV—II两种病原体的感染情况。结果HPV、CT和HSV-II的阳性检出率分别为24．9％、9．2％和8．9％，且随着宫颈病变程度加重而逐渐增高，宫颈炎组和宫颈癌病变组三种病原体的感染率差异均有统计学意义。HPV感染以高危型为主（占77．9％），低危型为22．1％。HPV高危型和阴性组比较两种病毒的感染率有统计学差异（CT：x^2=26．97，P〈0．05；HSV—Ⅱ：x^2=65．93，P〈0．05）。各宫颈病变组均有多病毒混合感染情况出现，其中宫颈癌组混合感染率为22．2％。结论HPV、CT和HSV—Ⅱ感染与宫颈癌的发生密切相关，多病原体混合感染会促进宫颈癌的发生。

肿瘤治疗的新突破:溶瘤病毒治疗

溶瘤病毒通过感染癌细胞,引起病毒性细胞病变并诱发宿主抗肿瘤免疫反应,从而选择性感染和杀死癌细胞。美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药物管理局(EMA)最近批准了世界上第一个用于治疗恶性黑色素瘤的溶瘤病毒制剂,命名为Imlygic。Imlygic为表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)活病毒颗粒,经直接注射入肿瘤组织引起肿瘤细胞裂解和机体抗肿瘤免疫双重效应。除了HSV-1外,尚有许多不同类型的病毒已经进入临床试验,评估其生物安全性和抗肿瘤疗效。这些正在临床试验的溶瘤病毒包括腺病毒、痘病毒、麻疹病毒和呼肠孤病毒等。治疗的肿瘤包括卵巢癌、腹膜癌、肝癌、胶质瘤和黑色素瘤等。目前,溶瘤病毒治疗肿瘤的临床试验约有67项,一些临床试验已经取得了有希望的结果,从而进展到第三期临床试验。该文重点讨论目前正在临床试验中用于治疗各类癌症的溶瘤病毒,并讨论这些溶瘤病毒作为一类新的癌症治疗药物的机遇和挑战。

U-2 OS细胞/CCK-8法测定1型单纯疱疹病毒溶瘤活性

目的:建立U-2 OS细胞/CCK-8比色法,用于测定1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)溶瘤活性。方法:选择3株对HSV-1敏感的的细胞株,在细胞培养板上以梯度浓度的HSV-1感染一定时间后,加入CCK-8进行显色,用酶标仪检测后采用四参数曲线法进行量效关系拟合。在选择出量效关系最好的细胞株基础上,对方法的各项实验条件进行优化,并采用活性测定标准品对结果进行校正分析。对建立的方法初步验证准确性和精密度,并用上述方法对3批样品的溶瘤活性进行检测。结果:优化后的实验采用U-2 OS细胞株,1∶4的样品系列稀释比例,5×10^4 PFU·mL^-1的样品系列稀释初始浓度,每孔2.5×10^4个细胞的铺板数量,72 h感染时间和4 h CCK-8试剂反应时间等条件进行样品测定,得到的四参数方程拟合的量效关系曲线R^2大于0.99,信噪比较高,初步验证结果显示该方法的回收率为113.4%,日间精密度分析的几何变异系数(GCV)为21.8%。3批测试样品的溶瘤活性分别为3.52×10^3、3.93×10^4和1.61×10^5 U·mL^-1。结论:建立的U-2 OS细胞/CCK-8法可用于以HSV-1为载体的基因治疗药物溶瘤活性测定。