基于重组李氏杆菌溶血素的阻断ELISA检测病原菌的研究

为建立利用重组李氏杆菌溶血素(LLO)检测单核细胞增生李氏杆菌的ELISA方法,试验首先优化了重组李氏杆菌溶血素的表达条件,获得纯度较高的包涵体之后,用亲和层析法纯化重组李氏杆菌溶血素蛋白,并用纯化蛋白免疫试验兔获得诊断抗体,然后建立阻断ELISA检测单核细胞增生李氏杆菌的方法,并分析最低检测菌数。结果表明:在振摇培养条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L、诱导温度为37℃、菌液OD600值为0.25时开始诱导,诱导时间为150 m in,重组李氏杆菌溶血素的表达量最大;纯化蛋白浓度为480μg/mL,具有免疫活性。说明建立的检测方法特异性好,最低检测菌数为4.8×106个/mL。提示利用重组李氏杆菌溶血素检测单核细胞增生李氏杆菌的ELISA方法是可行的,具有潜在的应用价值。

链球菌溶血素O的表达、纯化及生物活性鉴定

目的重组表达链球菌溶血素O(SLO),纯化后验证其生物学活性。方法合成目的基因,采用聚合酶链反应扩增、酶切连接的方式构建SLO-pET28a载体,经酶切和测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导表达条件优化,采用镍亲和柱和分子筛纯化SLO。分别检测重组SLO和天然SLO对试剂盒校准品的响应情况和与临床样本匹配程度。结果成功构建了SLO-pET28a-BL21(DE3)菌株,在OD600=0.8时,25℃,0.4mmol IPTG诱导,大于90%目的蛋白会可溶性表达。纯化后SLO纯度大于95%。重组的SLO与提取的SLO对试剂盒校准品的响应相当,与临床样本的匹配程度一致。结论重组SLO的生物学活性与提取相当,为检测血清中的抗链球菌溶血素O奠定了基础。

化脓性链球菌溶血素O活性结构重组蛋白的制备

生物信息分析化脓性链球菌溶血素O(streptolysin O,Slo)蛋白结构表明,Slo蛋白除含有由461氨基酸残基组成的溶血活性结构域Thiol_cytolysin外,在N端还有一跨膜结构域。利用pET101-GENE蛋白表达系统,成功构建出表达具有Slo活性重组蛋白的重组子,采用镍柱亲和层析分离技术,纯化目的蛋白;纯化蛋白SDS-PAGE检测分析表明,重组蛋白与预测的溶血活性结构域的分子量相一致;溶血实验显示,纯化重组蛋白具有溶血活性。以纯化的重组蛋白为免疫原,对大鼠进行4次免疫,所获得免疫血清经Elisa检测,抗Slo血清效价达到1∶12 800;Western blot检测猪链球菌、马链球菌和化脓性链球菌中的链球菌溶血素结果显示,抗Slo多克隆抗体仅能与化脓性链球菌溶血素O发生反应,表明研究制备的化脓性链球菌溶血素O活性结构重组蛋白抗原具有较好的特异性,所制备的抗原Slo可用于进一步开发抗链球菌溶血素O(ASO)试剂盒。

猪链球菌2型重组suilysin的高效表达及其生物学特性

根据猪链球菌2型(SS2)HA9801株溶血素(suilysin,SLY)基因全长序列设计引物,扩增SLY基因,与原核表达载体pET-28a连接,转入大肠杆菌Transetta(DE3)中诱导表达,收集表达菌体,超声破壁、镍柱纯化获得可溶性rSLY蛋白,电泳鉴定后测定rSLY的溶血活性及其溶血谱,系统研究温度、酸碱度、离子强度等理化因素对rSLY溶血活性的影响。结果表明,本试验建立的rSLY原核表达体系能高效可溶性表达具有溶血活性的rSLY,纯度达电泳纯,相对分子质量为54 000左右,100mL菌液诱导后能纯化出约8mg电泳纯的rSLY。rSLY具有高溶血活性,溶血比活为4 057HU/mg。rSLY对多种动物的红细胞有溶血作用,其中对猪、兔和豚鼠的作用最强。rSLY在4℃保存时溶血活性最稳定,保存48h后溶血活性不降低。在pH 6～7和离子强度为500mmol/L时溶血活性最高。本试验获得了高表达、可溶性、高溶血活性的rSLY,首次系统研究了不同理化因素对rSLY生物学活性的影响,为SLY致病机理深入研究及SS2亚单位疫苗和诊断试剂的研制奠定了基础。