外源性重组激活基因在人类细胞中的表达研究

目的:通过恢复RAG-1、RAG-2分子的表达挽救功能性淋巴细胞的分化、发育,探讨从基因水平上根治RAG-免疫缺陷病的技术方法,为进一步进行基因治疗打下基础。方法:(1)采用RT-PCR方法克隆人类RAG-1、RAG-2编码基因,同时构建RAG-1、RAG-2真核表达载体;(2)采用转染方法得到转染细胞体,使目的基因在人类细胞得到表达。结果:阳性克隆的测序结果与人类RAG-1、RAG-2基因完全相同,并且分别在获得重组细胞中检测到782 bp的人类RAG-1 mRNA转录产物和378 bp的人类RAG-2 mRNA转录产物,而pcDNA3.1空白对照未检测到任何hRAG-1 mRNA。结论:成功克隆了人类RAG-1、RAG-2基因,并在转染的人类细胞中获得了外源RAG-1、RAG-2的mRNA表达。

Channel catfish重组激活基因克隆与鉴定

目的 尝试用简并引物扩增序列未知的channelcatfish基因组DNA中rag1基因的片段并测序 ,为rag1基因的早期进化模式和遗传学变异情况的研究提供直接的证据。方法 基于rag1基因的高度保守设计简并引物 ,PCR扩增channelcatfish基因组DNA中rag1基因的片段 ,TA克隆并双向测序。将所得序列资料拼接 ,用多种生物信息学方法分析其ORF、内含子、与其它物种rag1基因及Rag1蛋白的相似性 ,并做多序列比较和系统进化树分析。结果 扩增出 3条chan nelcatfishrag1基因的DNA片段。从拼接后的序列中找到一 2 2 3 5bp的ORF和一 2 93bp的内含子 ,所得序列与其它物种rag1基因的相似程度高 (多大于 70 %) ,去除内含子后的channelcatfishrag1基因序列与zebrafish、rainbowtrout、bullshark的rag1基因cDNA全序列碱基一致的位点占 43 9%,自第 13 5 2位碱基至 2 92 5位碱基为 5 3 1%,而自第 1位碱基至 13 5 1位碱基为 3 3 2 %,有非常显著的差异 (P <0 .0 1)。结论 用简并引物成功扩增出channelcatfishrag1基因的DNA片段。序列在GenBank中的登记号是 :AY42 3 85 8(去除内含子序列 ) ,AY42 3 85 9。rag1基因进化缓慢 ,高度保守 ,不同物种rag1基因的变异相对集中在氨基末端的区域。系统进化树分析显示了 13种硬骨鱼在进化上关?

T细胞激活剂对Jurkat细胞重组激活基因表达的影响

目的:研究T细胞激活剂PHA,抗CD3mAb,PMA+A23187对人T细胞白血病细胞株Jurkat重组激活基因(RAGs)mRNA表达水平的影响.方法:采用RTPCR法检测不同T细胞激活剂作用不同时间后Jurkat细胞中RAG1,RAG2mRNA,以β肌动蛋白(βactin)的表达作为内参照进行灰度分析,比较不同组Jurkat细胞RAGsmRNA的表达水平.结果:三种T细胞激活剂刺激诱导的Jurkat细胞RAG1mRNA表达量明显低于对照组(P<0.05),且RAG1mRNA表达量的下降与刺激诱导作用时间有关;PHA刺激诱导后RAG2表达量显著低于对照组(P<0.05);PMA+A23187刺激诱导6,12h均未检测出RAG2mRNA的表达;而抗CD3mAb作用12h组RAG2mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05).结论:Jurkat细胞同时表达RAG1,RAG2mRNA,并在一定诱导下RAGs表达量发生改变,因此有可能成为研究外周T细胞RAGs表达调节的一个潜在的细胞模型.

重组激活基因研究进展

重组激活基因 (RAGs)的编码产物Rag1和Rag2组成最重要的重组酶 ,能特异地识别Ig和TCR的V、DH、J基因片段两侧的RSS ,并催化DNA双链断裂 ,引起V(D)J重排 ,是Ig和TCR库多样性的主要原因。RAGs在体内和体外激活的成熟B细胞中也能被诱导表达 ,在斑马鱼的嗅觉神经元中检测到第一例非淋巴组织中的RAGs共表达。

重组激活基因与临床疾病

ragl或rag2基因的错义突变可使其编码的重组酶活性部分受损,导致V(D)J重组发生倾向于产生单克隆的活化Th2的改变,结果引起一类严重的联合免疫缺陷综合征(SCID),称为Omenn syndrome(OS)。OS的准确诊断有赖于RAGs基因的直接测序分析,它也是目前在SCID和OS家族中调查胎儿是否受其遗传影响的最有效方法。RAGs基因编码的重组酶催化V(D)J基因重排时,发生的错误识别可导致抗原受体基因和癌基因染色体易位,是淋巴系统恶性肿瘤发生的重要因素。RAGs还可能与自身免疫性疾病等有关。

重组激活基因在免疫反应中的作用

基因的重排是淋巴细胞表面标志发生过程中的一个必要过程,对于细胞成熟后的功能和结构有着重要的作用。重组激活基因通过在组织中的表达能够激活B淋巴细胞抗原识别受体和T淋巴细胞抗原识别受体在细胞发生过程中进行重排,从而在免疫反应中发挥重要的调控作用。本文就重组激活基因的研究历史、它在免疫反应中的作用及最新的研究进展做一综述。

重组激活基因1shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

构建3对针对大鼠海马神经元重组激活基因(Rag1)的RNA干扰重组表达载体及1对无关序列的载体,分别命名为shRNA1、shRNA2、shRNA3及negative。经基因测序确认后,采用慢病毒载体系统分别包装4个载体,而后分别感染体外培养的大鼠原代海马神经细胞,收集感染后96h的细胞,通过免疫荧光观察细胞感染情况,并且利用RT-PCR和Western印迹检测Rag1mRNA及蛋白质的表达。经测序鉴定合成的shRNA序列正确,并且慢病毒感染细胞效果良好。LV-shRNA1组、LV-shRNA2组、LV-shRNA3组与正常对照组相比,Rag1mRNA表达都明显减少(P<0.01),其中LV-shRNA3组的抑制效率最高为(76.4±3.5)%,Western印迹结果与其基本一致,而LV-negative组对Rag1mRNA及其表达的蛋白质都无明显影响。实验结果表明,我们成功构建了能特异性抑制大鼠海马神经元Rag1表达的shRNA慢病毒表达载体。

重组激活基因

本文概述了能诱导可变、多样与连接片段重组（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｖａｒｉａｂｌｅ，ｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｊｏｉｎｉｎｇｇｅｎｅｓｅｇｍｅｎｔｓ）又称ＶＤＪ重组的两个重组激活基因（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｇｅｎｅｓ，ＲＡＧｓ）──ＲＡＧ－１和ＲＡＧ－２的研究现状，主要介绍了ＲＡＧｓ的发现过程、结构特征、功能以及激活ＶＤＪ重组的可能机制。

淋巴细胞特有重组激活基因蛋白载体构建及功能鉴定

目的:淋巴细胞特异性重组激活基因(RAG)蛋白1和2共同组成的RAG重组酶是造成淋巴细胞发育及产生抗体多样性的关键性蛋白.本研究构建并优化同时表达RAG1和RAG2的慢病毒载体,为研究RAG1和RAG2的结构和功能奠定基础.方法:构建同时表达RAG1、RAG2和绿色荧光蛋白(GFP)的载体;Western Blotting验证该载体RAG1和RAG2蛋白表达;体外重组实验证实该载体表达的RAG蛋白具有催化断裂DNA的功能.结果:构建了表达RAG重组酶的载体p WPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFP;Western Blotting验证了该载体表达RAG1和RAG2蛋白,并显示该载体RAG1和RAG2蛋白的表达量具有较高的一致性.体外重组实验证实该载体表达的RAG1和RAG2组成的重组酶具有更好的催化断裂DNA的活性.结论:优化后的p WPI-RAG2-P2A-RAG1-IRESGFP载体可以保证RAG1和RAG2同时有效表达,GFP可作为荧光标记,为后续细胞以及动物实验奠定基础.

重组激活基因-1在变应性鼻炎鼻黏膜中的表达及DNA测序研究

目的:探讨重组激活基因1(RAG1)在变应性鼻炎(AR)发病机制中的作用及其与IL4、IL10和IgE之间的关系及意义。方法:用卵清蛋白(OV)建立大鼠AR模型并用地塞米松(DEX)进行干预,用被动皮肤过敏原试验(PCA)测试皮肤反应并与正常对照组进行比较;用RTPCR技术检测各组鼻黏膜中RAG1基因mRNA的表达水平,并对RAG1基因的DNA进行测序;用ELISA法检测各组大鼠外周血清IL4、IL10和IgE的水平变化。结果:RAG1基因的mRNA在正常对照组鼻黏膜中未见表达,在AR组和DEX干预组均有明显表达;DNA测序未发现RAG1基因有突变发生;AR组血清IL4[(106.31±12.90)ng/L]和IgE[(38.67±4.13)ng/L]水平均显著高于正常对照组[(93.65±7.78)ng/L,(23.27±1.36)ng/L](均P<0.05),IL10[(38.15±4.89)ng/L]水平显著低于正常对照组[(48.74±3.49)ng/L](P<0.05);经DEX干预后,血清IL4[(92.67±16.40)ng/L]和IgE[(24.23±4.38)ng/L]水平均较AR组显著下降(均P<0.05),而IL10[(46.18±5.01)ng/L]水平较AR组显著升高(P<0.05);PCA试验在AR组90%呈阳性反应,在正常对照组和DEX干预组均呈阴性反应。结论:RAG1的高表达与AR的发病密切相关,并介导了IL4和IgE的分泌及抑制IL10的分泌。其DNA序列在AR鼻黏膜中具有保守性,糖皮质激素不影响RAG1基因的表达,推测在AR发病机制中,RAG1基因通过一个较高层面的免疫调节环节发生作用。

重组激活基因突变与免疫缺陷病表型多样性

重组激活基因（ recombination activating gene, RAG）突变导致一系列严重的免疫缺陷病，包括重症联合免疫缺陷（ severe combined immunodeficiency, SCID）、Omenn综合征以及多种其他特殊表型。不同患者因RAG分子表达受影响程度的差异而表现出复杂多样的免疫表型、组织病理学改变和临床表现。RAG完全缺陷分为典型SCID和母源T细胞输入型SCID。RAG残留缺陷包括典型Omenn综合征、非典型Omenn综合征、肉芽肿性炎症、18T细胞优势扩增型以及母源T细胞植入。患者的淋巴细胞分化发育受到完全或者部分阻断，导致反复感染，并且常伴随自身免疫反应，严重威胁生命。该文对RAG免疫缺陷的各种复杂表型进行归纳，为该疾病的正确诊断、针对性治疗以及发病机制研究提供参考。

V(D)J重排酶RAG与转座子及转座子基因编辑工具的关系

V(D)J重排是高等脊椎动物产生特异性抗体和受体的基础事件,是适应性免疫的特征,其关键酶重组激活基因(RAG)及V(D)J重排如何起源是免疫学中的一个基础问题。多种证据表明RAG和V(D)J重排可能起源于转座事件。本文就V(D)J重排酶RAG的功能,及其和原始RAG转座子的关系进行论述,同时思考RAG转座子和转座子基因编辑工具的联系,旨在为新型基因编辑工具研发和利用提供参考。

国产基因重组人尿激酶型原(Pro-urokinase/u-PA)Ⅰ期临床安全性、耐受性研究

目的:对国内研制的注射用基因重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂（Pro-urokinase,u-PA）进行Ⅰ期临床试验,以评价其用于中国健康成人受试者的安全性和耐受性。方法:试验日期;健康受试者23例（男11例,女12例）,随机分为5,20,35mg和50mg四个剂量组。静脉给药:其中1/4剂量在1min内静脉推注,其余3/4剂量在60min内静脉滴注完毕。给药前和给药后2,24h取外周血测定血液生化指标、凝血和纤溶指标,并随时观察受试者的全身状态和可能出现的药物不良反应。结果:全部受试者用药前后的血压,心率/律、呼吸等重要生命体征未见异常变化;血、尿常规、肝肾功能,电解质、空腹血糖等亦未见明显变化。与溶栓有关的血液学指标（活化的部分凝血活酶时间,凝血酶原时间,凝血酶原活动度,纤维蛋白原,α2-抗纤溶酶和纤维蛋白降解产物）,在部分受试者有改变,但变化均在正常范围内、且与剂量无明显相关,无明确临床意义。全部受试者注射药物的局部皮肤,无刺激性炎症和皮下淤血、出血等变化。结论:中国健康成人受试者对于上述剂量的基因重组人尿型纤溶酶原激活剂的安全性及耐受性良好。

V(D)J重组起始阶段的研究进展与展望

重组激活基因(recombination activating gene)1和2编码的RAG1和RAG2蛋白通过对V(D)J重组起始阶段的调节作用,使得抗原受体基因重排严格地按组织、细胞发育阶段进行。本文将就RAG蛋白结合和催化断裂抗原受体基因机制作简要介绍。这些新发现明确了体内V(D)J重组发生的部位以及其出现错误时可能发生的地方,提示V(D)J重组机制不仅对淋巴细胞正常发育起关键性作用,而且对基因组不稳定性和淋巴系统恶性肿瘤的发生也具有重要意义。

IKZF1基因在BCR/ABL融合基因阳性急性淋巴细胞白血病中的表达及机制探讨

目的:探讨IKZF1基因在急性淋巴细胞白血病中的表达特点及可能机制,进一步明确急性淋巴细胞白血病的发病机理。方法:收取80例急性淋巴细胞白血病患者的外周血标本,其中21例BCR/ABL融合基因阳性,均为B细胞急性淋巴细胞白血病。RT-PCR技术检测IKZF1基因、RAG1基因及RAG2基因的表达;提取细胞DNA,PCR技术检测IKZF1基因的缺失突变;二代测序了解IKZF1基因断裂点区域的碱基序列。结果:RT-PCR结果显示80例急性淋巴细胞白血病中19例表达IK6亚型,其中17例为BCR/ABL融合基因阳性B细胞急性淋巴细胞白血病,2例为BCR/ABL融合基因阴性B细胞急性淋巴细胞白血病。即IK6亚型的表达主要在B细胞急性淋巴细胞白血病中,且主要与BCR/ABL融合基因有关。PCR实验证实了BCR/ABL融合基因阳性B细胞急性淋巴细胞白血病中IKZF1基因发生了缺失突变。二代测序发现IK6亚型由IKZF1基因2号内含子和6号内含子异常断裂后拼接形成,断裂点处存在重组激活基因蛋白能靶向作用的cRSS序列。结论:IK6亚型的表达主要在B细胞急性淋巴细胞白血病中。IK6亚型的表达在急性淋巴细胞白血病中与BCR/ABL融合基因有关。IK6亚型的表达在BCR/ABL融合基因阳性急性淋巴细胞白血病中与重组激活基因蛋白靶向作用导致IKZF1基因2号和6号内含子断裂可能相关。

基于RAG2基因序列分析仿石鲈科鱼类及其相关种类系统进化关系

为探讨仿石鲈科鱼类目前存在的分类争议问题,测定了仿石鲈科(Haemulidae),金线鱼科(Nemipteridae),眶棘鲈属(Scolopsis)等相关科属共33种鱼类RAG2基因部分序列,利用最大简约法(MP法)和贝叶斯分析法(BI法),并以黄鹦嘴鱼作为外类群构建分子系统进化树。结果显示,33种鱼类共形成三大类群,其中仿石鲈科8个属聚成一类群,金线鱼属和眶棘鲈属的种类聚成另一类群,眶棘鲈属未能与仿石鲈科形成单系。同时,基于属间遗传距离比较,眶棘鲈属与金线鱼科的遗传距离比其与仿石鲈科各属的遗传距离要小得多,表明眶棘鲈属与金线鱼科有更近的亲缘关系,支持眶棘鲈属隶属于金线鱼科的观点。此外,传统分类资料中归类于仿石鲈科的髭鲷属(Hapalogenys)也没有与仿石鲈科聚成单系,而是独自形成一支,位于进化树基部,显示出髭鲷属与仿石鲈科关系较远,与近年来认为髭鲷属应该从仿石鲈科中划分出去的结果一致。在仿石鲈科内部,少棘胡椒鲷属(Diagramma)中的少棘胡椒鲷与胡椒鲷属(Plectorhinchus)的种类关系很近。在进化树上,少棘胡椒鲷位于胡椒鲷属的内部,花尾胡椒鲷最先分化出来,位于该分支基部,支持少棘胡椒鲷归为胡椒鲷属,名称沿用原来的学名胡椒鲷的观点。

人T细胞白血病细胞株Jurkat的TCR基因重排

背景与目的:近年的一些体外实验研究发现,重组激活基因(recombi-nationactivatinggene)编码的RAG1与RAG2(recombinationactivatinggenes,RAGs)蛋白能够介导DNA链的转位(transposition)作用,因而,可能与淋巴系统肿瘤性疾病的发生有关,但迄今尚未有明确定论。我们在实验中发现,代表T细胞发育成熟阶段的人白血病细胞株Jurkat同时表达重组激活基因RAG1和RAG2,并且经适当诱导后有RAGs表达的变化。本研究旨在确证Jurkat细胞是否发生RAGs介导的T细胞受体(T-cellreceptor,TCR)基因重排。方法:采用巢式和半巢式PCR检测T细胞受体D!-J!之间的信号结合T细胞受体删除DNA环(signaljointT-cellreceptorexcisionDNAcircles,sjTRECs);连接介导的PCR(LM-PCR)法检测TCRβ链位点重排中间物-重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)断点;RT-PCR法检测V(D)J重排第二阶段非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)途径中的核心蛋白Ku70/Ku80及末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)。结果:在Jurkat细胞DNA中检测到结合区具有多样性特征的TCRDβ2-Jβ2sjTRECs和RSS5′端和3′端断裂点,并检测到TdT、Ku70/Ku80的表达。结论:Jurkat细胞有TCR基因重排的发生。Jurkat细胞可能成为研究RAGs和TCR基因重排与T细胞淋巴瘤的一个潜在的细胞模型。

Rag1、Rag2基因缺陷小鼠的构建及在异种肿瘤移植中的应用

目的 建立重组激活基因,Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,并对其表型和异种肿瘤移植的成瘤性进行分析.方法 通过传统的胚胎干细胞（ES）细胞打靶、囊胚注射方式,分别构建Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型;通过流式细胞术对缺陷小鼠外周血T/B淋巴细胞含量进行检测;通过外源异种肿瘤细胞移植实验,对移植肿瘤细胞的成瘤性进行评价.结果 建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种基因突变纯合子小鼠模型外周血中T、B淋巴细胞含量较野生型小鼠显著降低;人源肿瘤细胞A549在上述两种基因突变纯合子小鼠中较BALB/c-nu（裸小鼠）或（NOD-SCID）非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠表现出更强的成瘤性.结论 分别成功建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种小鼠模型均发生了T、B淋巴细胞生成障碍,导致免疫系统严重缺陷,可作为异种外源肿瘤移植的受体,用于小鼠荷瘤模型的建立.

鲫鱼Rag基因的克隆及表达分析

DNA重组激活基因(Recombination activatinggenesRAG)是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因,也是脊椎动物进化分析的标记基因之一。鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力,是我国广泛养殖的重要经济淡水鱼;由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性,又是研究鱼类基因组进化的独特材料。本研究用PCR方法扩增、克隆了鲫鱼的Rag基因。鲫鱼Rag1基因从起始密码到终止密码总长4188bp,由三个外显子和两个内含子组成,其中开放阅读框长3192bp,编码1063个氨基酸。Rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,只有单一的编码区,编码530个氨基酸。Rag1和Rag2基因的ORF和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保守。不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的,转录因子结合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能结合位点。其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺发育相关的转录因子SRY和SOX5的可能结合位点,提示Rag1基因的表达可能与性腺发育具有相关性。用RT-PCR方法进行的组织特异性表达分析表明Rag1基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达,提示Rag基因不仅主导了免疫组织中的DNA重组,也可能参与了生殖细胞的DNA重组。RT-PCR检测证明Rag1基因在鲫鱼胚胎发育至第5天开始表达,在第7天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到Rag1基因mRNA的杂交信号,在第9天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强的Rag1 mRNA原位杂交信号,说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的活跃时期。

迟钝爱德华氏菌对杂交东方鲀rags基因表达的影响

利用实时荧光定量PCR技术检测冀研一号(菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂)稚鱼肝胰脏、脾脏、头肾中重组激活基因rags在腹腔注射迟钝爱德华氏菌后6、12、24、36、48、72h内相对表达量的变化情况。试验结果显示,感染迟钝爱德华氏菌后,肝胰脏中rags基因表达呈下降趋势,相对表达量峰值出现在攻毒后6h。脾脏和头肾中rags基因表达均呈先升后降趋势,但在攻毒后48h出现反弹回升。脾脏中,rags基因相对表达量峰值出现在攻毒后6h;头肾中,rag1基因和rag2基因相对表达量峰值分别出现在攻毒后48h和6h。与对照组相比,腹腔注射迟钝爱德华氏菌能引起冀研一号东方鲀rags基因表达上调,且rag1基因和rag2基因表达趋势基本一致。