重组激活基因1shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

构建3对针对大鼠海马神经元重组激活基因(Rag1)的RNA干扰重组表达载体及1对无关序列的载体,分别命名为shRNA1、shRNA2、shRNA3及negative。经基因测序确认后,采用慢病毒载体系统分别包装4个载体,而后分别感染体外培养的大鼠原代海马神经细胞,收集感染后96h的细胞,通过免疫荧光观察细胞感染情况,并且利用RT-PCR和Western印迹检测Rag1mRNA及蛋白质的表达。经测序鉴定合成的shRNA序列正确,并且慢病毒感染细胞效果良好。LV-shRNA1组、LV-shRNA2组、LV-shRNA3组与正常对照组相比,Rag1mRNA表达都明显减少(P<0.01),其中LV-shRNA3组的抑制效率最高为(76.4±3.5)%,Western印迹结果与其基本一致,而LV-negative组对Rag1mRNA及其表达的蛋白质都无明显影响。实验结果表明,我们成功构建了能特异性抑制大鼠海马神经元Rag1表达的shRNA慢病毒表达载体。

Rag1、Rag2基因缺陷小鼠的构建及在异种肿瘤移植中的应用

目的 建立重组激活基因,Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,并对其表型和异种肿瘤移植的成瘤性进行分析.方法 通过传统的胚胎干细胞（ES）细胞打靶、囊胚注射方式,分别构建Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型;通过流式细胞术对缺陷小鼠外周血T/B淋巴细胞含量进行检测;通过外源异种肿瘤细胞移植实验,对移植肿瘤细胞的成瘤性进行评价.结果 建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种基因突变纯合子小鼠模型外周血中T、B淋巴细胞含量较野生型小鼠显著降低;人源肿瘤细胞A549在上述两种基因突变纯合子小鼠中较BALB/c-nu（裸小鼠）或（NOD-SCID）非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠表现出更强的成瘤性.结论 分别成功建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种小鼠模型均发生了T、B淋巴细胞生成障碍,导致免疫系统严重缺陷,可作为异种外源肿瘤移植的受体,用于小鼠荷瘤模型的建立.

外源性重组激活基因在人类细胞中的表达研究

目的:通过恢复RAG-1、RAG-2分子的表达挽救功能性淋巴细胞的分化、发育,探讨从基因水平上根治RAG-免疫缺陷病的技术方法,为进一步进行基因治疗打下基础。方法:(1)采用RT-PCR方法克隆人类RAG-1、RAG-2编码基因,同时构建RAG-1、RAG-2真核表达载体;(2)采用转染方法得到转染细胞体,使目的基因在人类细胞得到表达。结果:阳性克隆的测序结果与人类RAG-1、RAG-2基因完全相同,并且分别在获得重组细胞中检测到782 bp的人类RAG-1 mRNA转录产物和378 bp的人类RAG-2 mRNA转录产物,而pcDNA3.1空白对照未检测到任何hRAG-1 mRNA。结论:成功克隆了人类RAG-1、RAG-2基因,并在转染的人类细胞中获得了外源RAG-1、RAG-2的mRNA表达。

IKZF1基因在BCR/ABL融合基因阳性急性淋巴细胞白血病中的表达及机制探讨

目的:探讨IKZF1基因在急性淋巴细胞白血病中的表达特点及可能机制,进一步明确急性淋巴细胞白血病的发病机理。方法:收取80例急性淋巴细胞白血病患者的外周血标本,其中21例BCR/ABL融合基因阳性,均为B细胞急性淋巴细胞白血病。RT-PCR技术检测IKZF1基因、RAG1基因及RAG2基因的表达;提取细胞DNA,PCR技术检测IKZF1基因的缺失突变;二代测序了解IKZF1基因断裂点区域的碱基序列。结果:RT-PCR结果显示80例急性淋巴细胞白血病中19例表达IK6亚型,其中17例为BCR/ABL融合基因阳性B细胞急性淋巴细胞白血病,2例为BCR/ABL融合基因阴性B细胞急性淋巴细胞白血病。即IK6亚型的表达主要在B细胞急性淋巴细胞白血病中,且主要与BCR/ABL融合基因有关。PCR实验证实了BCR/ABL融合基因阳性B细胞急性淋巴细胞白血病中IKZF1基因发生了缺失突变。二代测序发现IK6亚型由IKZF1基因2号内含子和6号内含子异常断裂后拼接形成,断裂点处存在重组激活基因蛋白能靶向作用的cRSS序列。结论:IK6亚型的表达主要在B细胞急性淋巴细胞白血病中。IK6亚型的表达在急性淋巴细胞白血病中与BCR/ABL融合基因有关。IK6亚型的表达在BCR/ABL融合基因阳性急性淋巴细胞白血病中与重组激活基因蛋白靶向作用导致IKZF1基因2号和6号内含子断裂可能相关。

肿瘤坏死因子α对人脐静脉内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂1表达及转录调控的影响

探讨肿瘤坏死因子α对人脐静脉内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂 1活性和mRNA表达的影响 ,以及纤溶酶原激活物抑制剂 1基因 5’上游序列的调控元件在该基因转录调控中的作用。体外培养人脐静脉内皮细胞 ,加入不同浓度肿瘤坏死因子α作用不同时间。采用发色底物法测定纤溶酶原激活物抑制剂 1活性 ,Northern印迹分析法测定纤溶酶原激活物抑制剂 1mRNA水平。基因重组技术构建四个含人纤溶酶原激活物抑制剂 1基因不同长度5’上游序列的荧光素酶报告基因质粒 ,瞬时转染进入内皮细胞 ,并测定荧光素酶的表达情况。运用聚合酶链反应和序列分析法对构建质粒上的三个AP 1元件分别进行定点突变。结果发现 ,不同浓度肿瘤坏死因子α作用人脐静脉内皮细胞后 ,纤溶酶原激活物抑制剂 1活性和mRNA表达量均明显增高 ;当转染质粒含有纤溶酶原激活物抑制剂 1基因上游序列 - 15 0 9 +90和 - 82 3 +90时 ,肿瘤坏死因子α使转染细胞的荧光素酶表达量比对照组明显增高 ;当转染质粒含有 - 5 5 3 +90和 - 4 7 +90时 ,肿瘤坏死因子α的诱导作用不明显。在纤溶酶原激活物抑制剂 15’上游序列的三个AP 1元件突变后 ,肿瘤坏死因子α的诱导作用明显降低。结果提示 ,肿瘤坏死因子α增强血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂 1活性与mRNA表达 ;?

重组激活基因-1在变应性鼻炎鼻黏膜中的表达及DNA测序研究

目的:探讨重组激活基因1(RAG1)在变应性鼻炎(AR)发病机制中的作用及其与IL4、IL10和IgE之间的关系及意义。方法:用卵清蛋白(OV)建立大鼠AR模型并用地塞米松(DEX)进行干预,用被动皮肤过敏原试验(PCA)测试皮肤反应并与正常对照组进行比较;用RTPCR技术检测各组鼻黏膜中RAG1基因mRNA的表达水平,并对RAG1基因的DNA进行测序;用ELISA法检测各组大鼠外周血清IL4、IL10和IgE的水平变化。结果:RAG1基因的mRNA在正常对照组鼻黏膜中未见表达,在AR组和DEX干预组均有明显表达;DNA测序未发现RAG1基因有突变发生;AR组血清IL4[(106.31±12.90)ng/L]和IgE[(38.67±4.13)ng/L]水平均显著高于正常对照组[(93.65±7.78)ng/L,(23.27±1.36)ng/L](均P<0.05),IL10[(38.15±4.89)ng/L]水平显著低于正常对照组[(48.74±3.49)ng/L](P<0.05);经DEX干预后,血清IL4[(92.67±16.40)ng/L]和IgE[(24.23±4.38)ng/L]水平均较AR组显著下降(均P<0.05),而IL10[(46.18±5.01)ng/L]水平较AR组显著升高(P<0.05);PCA试验在AR组90%呈阳性反应,在正常对照组和DEX干预组均呈阴性反应。结论:RAG1的高表达与AR的发病密切相关,并介导了IL4和IgE的分泌及抑制IL10的分泌。其DNA序列在AR鼻黏膜中具有保守性,糖皮质激素不影响RAG1基因的表达,推测在AR发病机制中,RAG1基因通过一个较高层面的免疫调节环节发生作用。

RAG1基因新发现变异位点的结构分析及致病性预测

目的探索胚胎植入前单基因遗传学检测(preimplantation genetic testing for monogenic,PGT-M)周期前与重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)相关的重组激活基因1(recombination activating gene 1,RAG1)基因结构和功能,并对其新发现变异位点进行致病性预测。方法针对2016年8月于中山大学附属第一医院生殖医学中心就诊的先证者的外显子报告及其父母外周血染色体核型及Sanger测序数据,利用PROVEAN、PolyPhen-2和Mutation Taster致病性预测软件对RAG1基因变异位点的基因结构、蛋白保守结构域进行分析,并对突变与野生型RAG1蛋白的结构进行三维结构重建,实现致病性的预测。结果双方均为RAG1基因突变携带者,突变位点位于11号染色体上,女方为c.946T>G(p.C316G)杂合错义突变,男方为c.11941196del(p.L399del)杂合整码突变。两个突变位点对应的氨基酸在人、黑猩猩、猪、牛、大鼠、小鼠6个物种中高度保守。二级三级结构重建显示,c.946T>G(p.C316G)突变导致对应的RING型锌指结构丧失结合锌离子的能力,c.11941196del(p.L399del)突变引起的第399位亮氨酸缺失导致氢键减少1条。结论推测RAG1两个新发现变异位点为可致病性突变,扩大了RAG1基因的突变谱,具有重要的研究价值。

V(D)J重组起始阶段的研究进展与展望

重组激活基因(recombination activating gene)1和2编码的RAG1和RAG2蛋白通过对V(D)J重组起始阶段的调节作用,使得抗原受体基因重排严格地按组织、细胞发育阶段进行。本文将就RAG蛋白结合和催化断裂抗原受体基因机制作简要介绍。这些新发现明确了体内V(D)J重组发生的部位以及其出现错误时可能发生的地方,提示V(D)J重组机制不仅对淋巴细胞正常发育起关键性作用,而且对基因组不稳定性和淋巴系统恶性肿瘤的发生也具有重要意义。

稻瘟菌蛋白激发子在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1,并在其上下游分别引入酶切位点EcoRI和XhoI,经双酶切后与诱饵质粒载体pLexA连接构建重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,将该重组诱饵质粒转入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中进行β-半乳糖苷酶整板分析检测自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为筛选番茄cDNA文库获得诱饵蛋白PemG1的相互作用蛋白奠定了基础。

固有淋巴细胞3型与人类免疫缺陷病毒-1感染

近年来，科研人员在黏膜部位发现一些新细胞群，这类细胞具有3个主要的共同特征：没有重组激活基因（RAG）依赖的重排抗原受体，缺乏髓系细胞和DC细胞的表型分子，具有淋巴细胞的形态［1］；因此，这群细胞被命名为固有淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILCs）。ILCs的前体细胞位于胎鼠的肝脏和成年鼠的骨髓［2］，其发育和维持需要细胞因子共用受体γ链［γc，白细胞介素（IL）-2Rγ］、DNA结合抑制因子2（Id2）和IL-7受体α亚单位［3］。ILCs是固有免疫的重要效应细胞，其功能主要表现在淋巴器官的形成和组织重塑；近来研究表明，ILCs亚群在抗微生物免疫的早期阶段具有重要的效应功能［4，5］，其还能帮助组织修复，共生细菌的控制和上皮完整性的维持。ILCs缺乏特异性抗原受体，但能产生一系列细胞因子来实现其效应功能。值得注意的是，ILCs细胞与辅助T细胞亚群类似，具有差异化的细胞因子分泌模式［6］。如部分ILCs细胞被刺激后能分泌Th17细胞相关的细胞因子IL-17和IL-22，而一些细胞亚群被刺激后分泌Th2细胞相关的细胞因子IL-5和IL-13［6］。

含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

目的 构建含HIV 1Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV 1Tat1 0 1 蛋白编码基因从pEV质粒中切出 ,插入到表达质粒LZRSpBMN Z中 ,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS Tat1 0 1 。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS Tat1 0 1 转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(ФNX)中 ,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化 (IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染ФNX细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清 ,并分别感染 2 93细胞 ,Westernblot检测Tat在 2 93中表达。与此同时 ,收集感染 2 93细胞培养上清 ,加入到HL3T1细胞 (HeLa HIV 1 LTR CAT报告基因 )中 ,共培养 72h后收集细胞 ,提取蛋白作CAT活性检测。结果 ①含Tat1 0 1 基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后 ,Tat在临时转染ФNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平 ;②临时转染病毒感染 2 93细胞 ,Tat在感染细胞中得到了表达 ,且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV 1的LTR启动子 ,使得其下游的CAT基因得到表达。结论 重组LZRS Tat1 0 1 反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白 ,且表达蛋白具有转录激活功能。

尼罗罗非鱼整胚原位杂交技术的建立和初步应用

为了研究尼罗罗非鱼胚胎发育和器官形成过程中基因功能和基因表达图式,本研究建立了尼罗罗非鱼的整胚原位杂交流程。尼罗罗非鱼的胚胎具有卵黄大、不透明、色素出现早等特点,因此现有鱼类整胚原位杂交方法不能完全适用于尼罗罗非鱼的胚胎,故本研究做了相应的调整和优化:通过提高H2O2的浓度和添加KOH,改良了尼罗罗非鱼胚胎的色素去除方法;使用冷丙酮代替蛋白酶K在提高胚胎通透性的同时保持胚胎完整;减少了探针回收和抗体回收后的洗涤次数,完善了结果的图像采集和胚胎保存方案。使用尼罗罗非鱼的重组激活基因Rag1作为探针基因,整胚原位杂交结果显示Rag1基因表达的位置与已报道的斑马鱼和日本青鳉的Rag1基因在胚胎中的表达位置高度保守,胚胎完整,基因表达位置清晰可见,表明此套尼罗罗非鱼的整胚原位杂交技术流程成功有效。

化痰通络方对急性脑梗死大鼠rt-PA溶栓后神经细胞凋亡途径中内质网应激相关基因GADD153/CHOP与JNK1表达的影响

目的:观察化痰通络方对急性脑梗死大鼠重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)溶栓后内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)后期神经细胞凋亡途径中生长抑制DNA损伤基因153(C/EBP homologous protein,GADD153/CHOP)和c-Jun氨基末端激酶-1(c-Jun NH2-terminal kinases-1,JNK1)基因表达的影响。方法:将160只健康SD大鼠随机分为假手术组,模型组,rt-PA组,化痰通络方联合rt-PA组(简称中药组)。采用自身栓子法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO),rt-PA组与中药组分别给予尾静脉注入rt-PA(5.67 mg·kg-1)及联合化痰通络中药(7.2 g·kg-1)干预,2次/d。于6 h,1,3,7 d 4个时相分别采用RT-PCR检测各组大鼠大脑皮质梗死区组织中GADD153/CHOP与JNK1 mRNA的表达,采用TUNEL法检测各组大鼠大脑神经元细胞的凋亡。结果:与假手术组比较,模型组在4个时相中GADD153/CHOP与JNK1基因表达均明显增高(P<0.05),同一时相内与假手术组比较,模型组神经元凋亡显著升高(P<0.05);与模型组比较,rt-PA组和中药组在4个时相中均可降低JNK1 mRNA的表达量(P<0.05),同时rt-PA组在1 d时可降低GADD153/CHOP mRNA的表达,而中药组可在6 h和1 d时同时降低其表达,差异显著(P<0.05),rt-PA组在1 d和7 d时相神经元凋亡明显低于模型组(P<0.05),中药组各个时相神经元凋亡均显著降低(P<0.05),但rt-PA组与中药组之间无明显差异。结论:化痰通络方可通过降低内质网应激后期神经细胞凋亡途径中GADD153/CHOP与JNK1 mRNA的表达,部分抑制神经细胞的凋亡,从而防治急性脑梗死溶栓后缺血再灌注的发生与发展。

基因重组可溶性补体受体Ⅰ型对大鼠脊髓损伤组织C9和Clusterin表达的影响

目的 探讨基因重组可溶性补体受体I型 (sCR1)对大鼠急性脊髓损伤组织补体固有成分C9及补体调节因子Clusterin表达的影响。方法 采用改良Allen重物打击法制成SD大鼠急性脊髓损伤模型 ,观察sCR1组与生理盐水 (NS)组在伤后 12h、1、3、7、14d时间点脊髓损伤组织中C9和Clusterin表达的部位及时程 ,并采用斜板实验评定两组大鼠的下肢运动功能 ,比较组间差异。结果 sCR1组及NS组在伤后各个时间点脊髓损伤组织中C9、Clusterin表达增强 ,并存在动态变化过程。sCR1组在伤后各个时间点C9表达均明显轻于NS组 (P <0 .0 1) ;sCR1组在伤后 12h、1、3d时间点Clusterin表达明显轻于NS组 (分别为P <0 .0 1、P <0 .0 1、P <0 .0 5 ) ,伤后 7、14d两组间差异无统计学意义。sCR1组在伤后 3、7、14d时间点大鼠下肢运动功能明显优于NS组 (分别为P <0 .0 5、P <0 .0 1、P <0 .0 1)。结论 基因重组sCR1可显著抑制大鼠急性脊髓损伤组织C9和Clusterin的表达 ,可通过抑制补体系统激活机制减轻继发性脊髓损伤。

云贵高原银星竹鼠的遗传多样性与遗传结构研究

作为一类营地下生活的啮齿动物,银星竹鼠Rhizomys pruinosus具有较高的食用价值和药用价值,已成为我国南方地区特种经济动物养殖业的重点发展物种。以核内重组蛋白激活基因1(RAG1)的基因片段为分子标记,采用分子生物学方法,本研究对来自12个采样点的173个银星竹鼠个体进行群体遗传分析,探讨该物种群体遗传多样性和遗传结构。序列多态性分析结果显示,银星竹鼠RAG1基因部分序列848 bp,共检测出多态性位点18个,其中单突变位点3个,简约信息位点15个。遗传多样性分析表明,173份样本共统计出RAG1基因单倍型11个,单倍型多样性为0.712±0.025,核苷酸多样性为0.002 64±0.003 71,显著低于其他啮齿动物。最大似然法、邻接法和贝叶斯法构建的系统发育树显示,银星竹鼠群体分化为3个分支,其谱系地理格局出现明显分化。同时,分子变异分析结果证实,银星竹鼠种群间的遗传变异极显著高于种群内的,说明该物种存在显著的遗传结构和遗传分化水平。上述研究结果综合表明,银星竹鼠群体的遗传多样性水平较低,遗传分化结构较为显著,这可能与该物种的地下生活方式、扩散能力弱、山脉河流阻隔作用、地质气候事件等因素有关。本研究结果将为云贵高原地区物种多样性、生物多样性保护提供科学的参考依据。

PACAP衍生多肽RDB的高效制备及其改善胰岛素抵抗作用的初步研究

为了制备垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)衍生多肽RDB并初步研究其改善脂肪细胞胰岛素抵抗的作用,利用基因工程技术,选用大肠杆菌偏爱密码子,以重叠延伸PCR方法合成RDB基因序列,定向插入到高效表达载体pKYB-MCS中,用大肠杆菌ER2566进行表达,融合蛋白经Chitin-Beads柱纯化后,利用β-巯基乙醇诱导蛋白内含肽的N端自剪切,释放目的肽,再用HPLC制备纯度较高的PACAP衍生多肽RDB,实现RDB的高效制备;利用制备的重组肽RDB研究其对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的改善作用及初步机制。制备的重组肽RDB的Mr为3.990 k,纯度大于95%,其产率为17.3 mg/L发酵产物;制备的RDB可明显促进胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖利用及信号分子IRS-1的表达。结果表明在确立的优化条件下可高效制备纯度较高的PACAP衍生多肽RDB(纯度≥95%),RDB能改善胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感性,其作用机制与胰岛素信号通路相关蛋白的表达有关。