重组腺病毒介导的人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因在肝癌细胞中的表达

目的 观察腺病毒载体对肝癌细胞的转染效率及其介导的人野生型 p5 3、GM CSF和B7 1基因在肝癌细胞中的表达。方法 不同MOI的Ad GFP感染肝癌细胞 ,48h后计算感染效率 ;BB 1 0 2以5 0MOI感染肝癌细胞 ,48h后免疫组化法及westernblot检测 p5 3表达 ,ELISA检测GM CSF的含量 ,FACS测定B7 1的表达。结果 MOI为 5 0 pfu/细胞时对肝癌细胞的转染效率达 80 %以上 ,目的基因均可在肝癌细胞中高效表达。结论 腺病毒载体对肝癌细胞具有较高的转染效率 ,目的基因均可在肝癌细胞中高效表达 ,为进一步研究BB 1 0

冠心病伴抑郁障碍与5-羟色胺转运体基因及纤溶酶原激活物抑制物-1基因多态性关系

目的探讨冠心病伴抑郁障碍与5-羟色胺转运体基因及纤溶酶原激活物抑制物-1基因4G/5G多态性的关系。方法选择对照组63例、单纯抑郁组56例、单纯冠心病组91例和冠心病伴抑郁组75例,采用聚合酶链反应技术检测受试对象5-羟色胺转运体基因上游调控区多态性位点(5-HTTLPR)与内含子2区(5-HTTVNTR)及纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)基因4G/5G多态性的基因型。结果单纯抑郁组、冠心病伴抑郁组5-HTTLPR的SS基因型(分别为50%和51%)及S等位基因频率(分别为0.69和0.68)明显高于对照组和单纯冠心病组(P<0.05);单纯抑郁组、冠心病伴抑郁组LL基因型(分别为13%和15%)及L等位基因频率(分别为0.31和0.32)显著低于对照组和单纯冠心病组(P<0.05)。单纯冠心病组、冠心病伴抑郁组PAI-1基因4G/4G基因型(分别为47%和48%)及4G等位基因频率(均为0.68)显著高于对照组和单纯抑郁组(P<0.05);单纯冠心病组、冠心病伴抑郁组5G/5G基因型(均为12%)及5G等位基因频率(均为0.32)显著低于对照组和单纯抑郁组(P<0.05),5-HTTVNTR基因型(12/12,12/10,10/10)分布各组差异无显著性(P>0.05),冠心病伴抑郁组SS+4G/4G联合基因型显著高于对照组、单纯抑郁组和单纯冠心病组(分别为27%、13%、13%和10%,均P<0.05)。结论5-HTTLPR基因SS基因型和PAI-1基因4G/4G基因型共存与冠心病伴抑郁障碍发病相关。

重组人肝再生增强因子对肝纤维化大鼠基质分解素-1基因表达的影响

为了解重组人肝再生增强因子 (hALR)对肝纤维化大鼠基质分解素 1(MMP3 )基因表达的影响 ,建立CCl4 中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型 ,模型完成后予不同剂量hALR治疗 ,在不同的时间点留取大鼠肝组织标本 ,提取总RNA ,用逆转录定量聚合酶链反应 (RT PCR)测定MMP3 的基因表达水平。结果在两种模型中hALR治疗组大鼠肝组织MMP3 的基因表达水平在治疗过程中的不同阶段均明显高于模型组 ;高剂量hALR组大鼠肝组织基质分解素 1的基因表达水平均明显高于低剂量组。提示hALR可增强肝纤维化大鼠MMP3

带J链的α-防御素-1的基因重组和表达载体的构建

目的 将α防御素 1(HNP 1)改建为一种杀菌分子J链α防御素 1(J HNP 1) ,这种杀菌分子具有与细胞膜上具备的多聚IgA受体(PIgR)相结合而进入粘膜上皮细胞的能力,发挥其杀菌作用。即克隆人Jchain HNP 1嵌合基因DNA ,并构建真核表达载体。方法 将从pCH质粒中获取的J链片段,采用人工连接方法与HNP 1片断相连接,并将其构建于新型哺乳动物细胞质粒表达载体pcDNA3 .1( ) Myc HisC中,进行序列测定。结果 经过重组得到的J链防御素 1的目的片断为786bp ,序列分析与GenBank中报道的编码J链及HNP 1成熟肽的序列完全一致。结论 Jchain HNP 1嵌合基因DNA的克隆和哺乳动物细胞表达载体的构建,为进一步进行抗菌肽的研究及制备奠定了基础。

纤维蛋白溶解酶原激活物抑制物-1基因多态性与抑郁发作及冠心病的关系

目的探讨纤维蛋白溶解酶原激活物抑制-1(PAI-1)基因4G/5G多态性与抑郁发作和冠心病的相关性。方法选取抑郁发作患者42例、冠心病患者65例和健康个体132例,分别组成抑郁发作组、冠心病组和健康对照组,应用等位基因特异性PCR的方法了解各组PAI-1基因4G/5G多态性情况。结果抑郁发作组和冠心病组的4G/4G基因型频率和4G等位基因频率均高于健康对照组(P<0.05),抑郁发作组与冠心病组PAI-1基因-675位点的4G/4G基因型频率和4G等位基因频率均差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PAI-1基因4G/4G基因型和4G基因可能与抑郁发作与冠心病都有关,推测与两者伴发有一定联系。

共表达口蹄疫病毒VP1-2A基因与猪IL-2重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

构建共表达口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因和猪白细胞介素2(IL-2)基因的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。将FMDV VP1-2A基因和猪IL-2基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中,在受体菌中与腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3同源重组。重组腺病毒质粒转染HEK-293A细胞,得到重组腺病毒rAd5VP1-2A-Po IL-2。MTT法检测重组IL-2的生物活性。用rAd5VP1-2A-poIL-2免疫接种小鼠,同时设免疫单独表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5VP1和空腺病毒的对照组。通过检测淋巴细胞增殖功能,特异性抗体分泌,IL-4和IFN-γ的表达水平衡量rAd5VP1-2A-poIL-2对小鼠特异性免疫应答的影响。结果显示,成功获得了rAd5VP1-2A-poIL-2,MTT法检测重组IL-2具有生物学活性。小鼠免疫试验结果显示,与rAd5VP1免疫组相比,rAd5VP1-2ApoIL-2免疫既能增强重组病毒诱导小鼠淋巴细胞增殖的能力,又能提高重组病毒诱导小鼠特异性抗体的水平。细胞因子检测结果显示,串联IL-2能促进重组病毒诱导Th1和Th2的分化。研究结果说明,rAd5VP1-2A-poIL-2可望成为口蹄疫的候选疫苗。

广东汉族人纤溶酶原激活剂抑制物-1基因4G/5G多态性与2型糖尿病肾病的相关性

目的探讨纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)基因4G/5G多态性与广东汉族人2型糖尿病肾病(DN)发病的关系.方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析,对147例病史7年以上的2型糖尿病患者[其中DN患者77例,糖尿病非肾病(DNN)患者70例]和26名健康人进行了PAI-1基因4G/5G多态性分析.结果DNN组PAI-1基因的4G/4G基因型、基因频率显著高于DN组(x2=13.008,P＜0.01);与5G/5G基因型相比,DNN组PAI-1基因4G/4G型对DN组的比数比为1.447,95%的可信区间:0.533～3.934(P＜0.05),差异有显著性.而DN与DNN组PAI-1基因4G等位基因频率无显著差异(x2=1.22,P＞0.05);结论PAI-1基因4G/4G基因型与广东汉族人2型DN的发病有关联,4G/4G基因型广东汉族2型糖尿病人易发生DN.

纤溶酶原激活物抑制剂-1基因启动子区4G/5G多态性与IgA肾病肾小球硬化的相关性研究

目的 探讨原发性肾小球疾病患者中纤溶酶原激活物抑制物 1(PAI 1)基因多态性及其产物与IgA肾病肾小球硬化的关系。 方法 随机收集上海地区汉族人种IgA肾病患者 98例 ,其中伴肾小球硬化者 (G组 ) 5 3例 (5 4 % ) ,无肾小球硬化者 (non G组 ) 4 5例 (46 % ) ,另设 95名健康体检者为对照组。采用发色底物法测定血浆PAI 1,采用等位基因特异多聚酶链反应 (ASPCR)法进行PAI 14G/ 5G基因型分析。结果 G组的 4G/4G基因型发生频率 (45 .3% )、4G等位基因频率 (0 .6 7% )显著高于non G组 (13.3%、0 .4 1% ,P值均 <0 .0 5 )。而G组 5G/ 5G基因型的发生频率 (11.3% )则显著低于non G组 (31.1% ,P <0 .0 5 ) ;IgA肾病患者和对照组中携带 4G/ 4G基因的患者血浆PAI 1水平显著高于其他基因型 (P值分别 <0 .0 5和 <0 .0 1)。结论 PAI 14G/4G基因型和 4G等位基因与肾小球硬化显著相关 ,PAI 14G/ 4G基因型携带者血浆PAI

基因重组胰高血糖素样肽-1(GLP-1)衍生物优化

目的研究利用基因重组方法生产人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)衍生物的最佳表达及纯化条件。方法选用大肠埃希菌偏爱密码子,以含人GLP-1的质粒为模板,用重叠PCR方法合成全长人GLP-1衍生物基因,并定向插入到高效表达载体pMFH中,用大肠埃希菌BL21进行表达,融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,用C18 Sep-Pak反相柱脱盐,然后融合蛋白经甲酸水解,水解产物经Ni-NTA柱和高效液相色谱(HPLC)纯化、制备后,目的肽由质谱鉴定。结果利用载体pMFH在BL21中,GLP-1衍生物的最佳诱导表达温度为37℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的最佳浓度为0.6 mmol/L,最佳诱导表达时间为6 h;HPLC分析和制备GLP-1衍生物最佳洗脱条件为:30 min线性梯度洗脱,流动相A(100%乙腈)由10%至70%,流动相B(100%水,0.1%三氟乙酸)由90%至30%;流速1 ml/min;检测波长280 nm;质谱鉴定GLP-1衍生物的分子量为5548Da,与理论值相符合。结论在最佳表达及纯化条件下可得到高产量和高纯度(>98%)的GLP-1衍生物。

表达谱基因芯片技术研究膦甲酸钠上调细胞凋亡蛋白酶激活因子-1基因的表达

目的:了解膦甲酸钠(PFA)与细胞凋亡蛋白酶激活因子-1(APAF-1)基因启动子的关系,为PFA的作用机制提供理论依据。方法:应用基因表达谱芯片技术对于膦甲酸钠刺激Jurkat细胞之后的基因表达谱进行研究。聚合酶链反应(PCR)扩增APAF-1基因启动子,命名为APAF-P。以T-A克隆法,将APAF-P基因片段连入栽体pGEM-T。将获得的质粒pT-APAF-P,与报告质粒pCAT3-basic分别用KpnⅠ和NheⅠ双酶切后构建APAF-1启动子报告基因表达载体pCAT3-APAF-P,以重组表达质粒pCAT3-APAF-P瞬时转染Jurkat细胞,以转染pCAT3 basic的Jurkat细胞为阴性对照,PFA刺激后24小时收获细胞。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果:表达谱基因芯片研究结果表明,PFA可上调APAF-1基因表达水平达2.815倍。构建的报告载体pCAT3-APAF-P经过序列分析和酶切鉴定正确。pCAT3-APAF-P和PFA瞬时转染的Jurkat细胞的CAT表达活性是CAT3空载体的4.9倍,pCAT3-Weep的2.9倍。结论:PFA可以上调APAF-1启动子的活性,进而上调APAE-1基因的表达。为深入了解PFA的免疫调节作用及其在病毒的清除过程中的作用机制提供新的理论依据。

血浆纤溶酶原激活物抑制因子-1基因启动子多态性与2型糖尿病、高血压病、冠心病的关系

目的:探讨中国人群中血浆纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)基因变异和2型糖尿病(DM)、高血压病、冠心病的关系。方法:对281例门诊及住院病例,根据口服糖耐量试验(OGTT)分为非DM组(糖耐量正常者,糖耐量低减者)和2型DM组;并根据血压分为高血压病(HT)组和非高血压病(NGT)组。分析他们PAI-1基因启动子多态性。结果:2型DM者和非DM者相比:PAI-1基因型频率及等位基因频率有明显的统计学差异(x2分别为6.0和6.3,P<0.05);在DM组中冠心病者和非冠心病者相比:冠心病者PAI-1基因型频率及等位基因频率具有明显的统计学差异(x2分别为6.9和7.6,P<0.05和P<0.01);非条件多因素Logistic回归发现:冠心病和年龄有显著关系(P<0.001),与PAI-1基因多态性也有显著意义(P<0.01),与肥胖也有明显意义(P<0.05)。结论:PAI-1基因启动子多态性可能是冠心病的遗传因素;PAI-1基因突变可能是2型DM并发冠心病的危险因素;年龄、肥胖可能是冠心病的危险环境因素。

Ras蛋白激活物类似物-1基因在胃癌细胞株中的表达及生物学意义

目的:研究Ras蛋白激活物类似物-1基因(Ras protein activator like-1,RASAL1)在正常胃黏膜上皮细胞、胃癌细胞株中的表达情况及其生物学意义。方法:采用RT-PCR和Western blot分别检测高分化胃腺癌细胞株MKN-28、中分化胃腺癌细胞株SGC-7901、低分化胃腺癌细胞株BGC-823和正常胃黏膜上皮细胞株GES-1中RASAL1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达,应用基因测序法检测上述3种胃癌细胞株中K-Ras基因第一外显子第12密码子点突变情况,并分析其意义。结果:RT-PCR和Westernblot检测结果显示,与正常胃黏膜上皮细胞相比,在3种不同分化胃腺癌细胞株中,RASAL1基因的表达在mRNA水平和蛋白水平均下调(P<0.05),分化程度越低表达下调越明显;测序结果表明3种胃腺癌细胞株中均未发现K-Ras基因第一外显子第12密码子点突变。结论:RASAL1基因在含野生型K-Ras的胃癌细胞中呈低表达状态,其表达水平与胃癌的恶性程度有一定的关系。

猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。

纤溶酶原激活物抑制物-1基因4G/5G多态性与冠心病的关联研究

目的探讨纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)基因4G/5G多态性与冠状动脉疾病的关系。方法采用病例对照研究的方法。病例组146例,72例行冠状动脉造影证实患有CAD;正常对照组113例,选自人群健康体检者,所有入选病例均排除CAD史,脑卒中短暂性脑缺血发作病史及相似病史,排除周围血管疾病史。均用PCR-RFLP的方法判断各组基因型,最后进行统计学分析。结果与5G/5G相比,4G/5G,4G/4G的OR呈增加趋势,提示4G等位基因与冠心病的危险性相关。具有4G/4G基因型比具有5G/5G基因型的人患冠心病的危险性增加2.06倍(95%CI:1.03～4.14)。结论 PAI-1基因4G/4G基因型与中国汉族人群冠心病发生相关。

重组腺病毒介导人野生型p53和B7-1基因在喉癌细胞中的高效转移和高水平表达(英文)

为开展肿瘤的复合基因治疗,构建以串联方式携带人野生型p53和B7-1基因的重组腺病毒穿梭质粒pXC53/B7-1。将pXC53/B7-1与腺病毒包装质粒GT4050共转染293细胞,通过细胞内同源重组获得重组腺病毒Ad-p53/B7-1。在293细胞中扩增病毒,并通过氯化铯密度梯度超速离心纯化病毒,获得高滴度和高纯度的病毒。分别经免疫组织化学分析和流式细胞分析检测Ad-p53/B7-1介导的人野生型p53和B7-1基因在喉癌细胞Hep-2中的表达。结果表明Ad-p53/B7-1能够有效地将其所携带的目的基因导入Hep-2细胞并使其在细胞中高效表达。

糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1基因重组蛋白锚定自体肿瘤细胞膜提高抗肿瘤免疫反应的实验研究

目的研制抗肿瘤免疫治疗的新疫苗。方法用含目的基因的质粒pcDNA3-GPI-B7-1转染CHO/DHFR+细胞,提取膜蛋白GPI-B7-1,经Western blot鉴定后,用蛋白转化法锚定在肿瘤细胞膜上,免疫C57BL/6小鼠后,取小鼠脾细胞进行T细胞扩增和CTL功能检测,并检测细胞培养液和小鼠血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ水平。结果用GPI-B7-1修饰的肿瘤细胞膜免疫小鼠后可诱发肿瘤特异性T细胞扩增和CTL活性增强,细胞培养液中细胞因子检测为阳性。结论该疫苗能激发小鼠的免疫功能,具有一定的保护小鼠免受肿瘤细胞侵袭的作用。

促血管生成素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带小鼠促血管生成素-1(Ang-1)基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法化学合成小鼠Ang-1基因经PCR扩增后亚克隆至穿梭质粒,重组质粒转化感受态细胞,所得转化子经PCR电泳分析并测序鉴定,携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK 293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定重组腺病毒滴度,所得腺病毒转染293T细胞48 h收集培养上清,通过Western Blot分析Ang-1蛋白的表达。结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kbp的特征性条带,测序结果显示基因序列与Gen Bank提供的Ang-1序列一致,经HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×109pfu/ml,转染293T细胞后培养上清Western Blot分析可见大小58 k D特征性条带,即转染后能分泌正确大小的重组Ang-1蛋白。结论 Ang-1基因重组腺病毒载体可成功构建,为进一步研究Ang-1蛋白对造血干细胞动员及血管新生的作用提供实验依据。

纤溶酶原激活物抑制物-1基因第四内含子(CA)n多态性与脑梗死的关系

目的探讨纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)基因第四内含子(CA)n多态性与脑梗死的关系。方法采用扩增片段长度多态性及银染技术,分析95例脑梗死患者和60例对照者的血浆PAI-1基因第四内含子(CA)n多态性,用发色底物分解法测定血浆PAI-1活性。结果脑梗死组血浆PAI-1活性明显高于对照组。(CA)n二核苷酸重复数少者血浆PAI-1活性较高,长重复数多者频率在脑梗死组较低。结论PAI-1基因第四内含子(CA)n二核苷酸重复数少可致血浆PAI-1活性增高,并参与脑梗死的发病。

重组腺病毒介导人野生型p53和B7-1基因诱导喉癌细胞凋亡并增强其免疫原性

为开展喉癌的复合基因治疗,观察共表达人野生型p53和B7-1基因的重组腺病毒Ad-p53/B7-1对喉癌细胞增殖及免疫原性的影响。检测到Ad-p53/B7-1介导的人野生型p53基因可抑制喉癌细胞增殖并诱导其凋亡,同时B7-1基因的导入可增强喉癌细胞的免疫原性基因修饰的癌细胞可刺激自体肿瘤浸润淋巴细胞增殖,并诱导外周血淋巴细胞形成对肿瘤具有特异杀伤性的细胞毒性T淋巴细胞。