重组牛乳铁蛋白N末端多肽对真空包装猪肉品质的影响

以Nisin和乳酸作为参照,采用本试验室获得的重组牛乳铁蛋白肽对生鲜猪肉进行保藏试验。生鲜猪肉浸沾并真空包装后置于4℃下存放,测定肉样的微生物数、抗氧化值(TBA)、pH值、肉的红度值(Huntera)及感官评价。结果显示,重组的牛乳铁蛋白肽保鲜效果优于Nisin组,接近乳酸组。其保鲜期可达到19d。

重组牛乳铁蛋白肽包含体的复性与纯化

通过分析透析液pH值,包含体蛋白浓度,DTT浓度3个参数对复性率的影响,确定了重组牛乳铁蛋白N-末端多肽(pGEX-4T1/rbLF-N)包含体透析复性的最佳条件和复性后蛋白纯化的适宜方法。采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B柱(Glutathione SapharoseTM 4B)对复性后的蛋白溶液进行纯化,纯化后的融和蛋白经胃蛋白酶酶解并检测其酶解产物的抗菌活性。试验表明包涵体蛋白可以部分复性。当pH值为8.5,包含体蛋白质量浓度为100mg/L,DTT浓度为24 mmol/L时,包含体的复性率最高。纯化后的融合蛋白酶解产物具有抗菌作用。

重组猪源罗伊氏乳酸杆菌分泌表达牛乳铁蛋白肽对新生仔猪生长性能的影响以及抗腹泻病毒感染的保护作用研究

本试验旨在研究分泌表达牛乳铁蛋白肽(LFCA)的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌对新生仔猪生长性能的影响以及对引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的保护作用。试验1:选取36头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为3组,分别为重组菌组、空载菌组和对照组,每组12头仔猪,分别口服表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA/LR-CO21、含有空载体质粒的重组猪源罗伊氏乳杆菌pPG/LR-CO21和磷酸盐缓冲液(PBS)各4 mL,连续口服3 d,口服后观测时间为14 d。期间仔猪自由采食,记录各组仔猪体重变化和腹泻情况。试验2:选取30头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为5组,分别口服1、3、6、9、12 mL半数组织培养感染剂量(TCID 50)为10-7.50/mL的TGEV。设置7 d时间为观察期,分析半数致死量的条件。试验3:另选取1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪32头,随机分为4组,分别为重组菌组、空载菌组、对照组、TGEV感染组,每组8个重复,每个重复1头仔猪。试验组每天每头按照2×1010 CFU的剂量口服pPG-LFCA/LR-CO21、pPG/LR-CO21及等体积的PBS,连续口服饲喂1周,在8日龄按照半数致死量口服TGEV感染,感染7 d后进行样品采集。记录各组仔猪体重变化和腹泻情况;苏木精-伊红(HE)染色检测小肠绒毛高度及隐窝深度;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测仔猪血清中总免疫球蛋白G(IgG)和肠黏液总分泌型免疫球蛋白A(sIgA)抗体含量;实时荧光定量PCR检测紧密连接蛋白相关基因封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白-1(ZO-1)以及炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及Toll样受体2(TLR2)的mRNA相对表达量;对仔猪盲肠内容物进行菌群结构分析。结果表明:口服重组猪源罗伊氏乳酸杆菌后,与对照组相比,重组菌组新生仔猪的平均日增重极显著提高(P<0.01),而腹泻率降低且差异极显著(P<0.01);与TGEV感染组相比,重组菌组仔猪平均日增重增加且腹泻率降低,差异显著(P<0.05);空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度的比值显著增加(P<0.05);仔猪血清中总IgG和肠黏液总sIgA抗体含量显著升高(P<0.05);肠黏膜组织中紧密连接蛋白相关基因Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),血清中细胞因子TNF-α含量极显著降低(P<0.01),血清IFN-γ、IL-6、IL-8、TLR2含量极显著升高(P<0.01),仔猪存活率提高。对仔猪盲肠内容物进行菌群多样性分析结果显示,TGEV感染仔猪后肠道正常菌群占比下降,相比于TGEV感染组,口服重组菌的仔猪肠道菌群致病菌拟杆菌属占比下降,差异显著(P<0.05),菌群多样性更接近对照组,肠道菌群的代谢、遗传信息处理等功能均有所增强。综上所述,本试验成功构建了分泌表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌菌株,经口服途径饲喂新生仔猪后,能够促进仔猪生长,降低新生仔猪的腹泻率,经口服途径饲喂感染TGEV的新生仔猪后,可以改善肠道环境,降低病毒对仔猪肠道的损伤,对仔猪抗TGEV感染提供有效保护。

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究

为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。

表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌对雏鸡抗鸡白痢沙门氏菌感染的效果研究

为探索表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363对雏鸡抗鸡白痢沙门氏菌感染效果的影响,本实验将该重组乳酸乳球菌饲喂1日龄雏鸡,连续饲喂14 d,并设立空白对照组,第7 d时经灌服鸡白痢沙门氏菌同时感染实验组和对照组,连续观察7 d;分别于攻菌前以及攻菌后的不同天数采集血清及盲肠黏液,检测结果显示攻菌后饲喂重组乳酸乳球菌组雏鸡血清中IgG以及黏液中SIgA的含量极显著高于空白对照组。对各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏及十二指肠进行病理组织学检查,结果显示饲喂重组乳酸乳球菌组各器官的病变情况相对较轻,而且雏鸡盲肠扁桃体中非特异免疫信号通路中相关分子TLR4、My D88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6等的m RNA表达相对较高。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌在抗鸡白痢沙门氏菌感染的过程中可以起到保护雏鸡免受感染的作用。

重组大肠杆菌BL21(DE3)/rbLF-N高密度培养条件优化

研究了6种不同培养基,pH值和诱导条件对表达量的影响。结果表明,培养基为2×TY+M9+微量元素溶液,pH值为7.0,在对数生长中后期(OD600=1.96)用浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h,rbLF-N的表达量最高,达到25.2%。在此条件下,用Bioengineering 19 L自控式发酵罐,以pH-stat的培养技术,高密度培养重组E.coli BL21(DE3)/pGEX-4T1,生产重组牛乳铁蛋白N末端多肽(recombinant bovine lactoferrin-N polypeptide,rbLF-N)。通过控制pH值、溶解氧以及补料方式,使工程菌E.coli BL21(DE3)/pGEX-4T1的发酵菌体OD600值达到72.6,发酵菌体干重为31.9 g/L,rbLF-N表达量为菌体总蛋白的26.8%。

乳酸乳球菌表达重组牛乳铁蛋白肽的抑菌活性分析

牛乳铁蛋白肽是由牛乳铁蛋白经消化酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的短肽;乳酸乳球菌作为食品级微生物,既有天然的益生作用,又是理想的表达牛乳铁蛋白肽的载体。【目的】探究重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363表达牛乳铁蛋白肽的抑菌活性。【方法】利用牛乳铁蛋白肽标准品绘制定量标准曲线来确定重组牛乳铁蛋白肽的含量,利用牛津杯法及微量肉汤稀释法测定重组牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等35株细菌的抑菌活性及最小抑菌浓度,利用扫描电镜、透射电镜、荧光显微镜、凝胶阻滞试验、黏附试验来探究重组牛乳铁蛋白肽对菌体结构、细菌DNA及黏附力的影响,利用CCK-8检测其对RAW 264.7细胞的毒性作用,并对小鼠红细胞溶血率进行测定。【结果】重组乳酸乳球菌上清中牛乳铁蛋白肽的浓度为24.39μg/mL,重组牛乳铁蛋白肽对测试的25株致病菌均有不同程度的抑制作用,抑菌浓度范围在16–128μg/mL,但对9株乳酸菌以及粪肠球菌没有明显的抑制作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门菌的菌体完整性具有不同程度的破坏作用,其主要作用靶点为细菌的细胞膜,可以与细菌DNA结合并抑制细菌对Caco-2、IPEC细胞的黏附作用,重组牛乳铁蛋白肽对小鼠红细胞及RAW 264.7细胞没有明显的细胞毒性。【结论】乳酸乳球菌表达重组牛乳铁蛋白肽的抑菌活性与牛乳铁蛋白肽标准品相一致,通过直接作用于细菌细胞膜、胞内核酸或抑制细菌对正常细胞的黏附作用等多方面实现抑制或杀死细菌,发挥广谱的抗菌活性,且对真核细胞没有明显的细胞毒性作用。

杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素-天蚕素在大肠杆菌中的高效表达及其活性鉴定

【目的】菌株耐药性问题日益突出,研制新型安全高效的抗菌药物成为目前的研究热点之一。抗菌肽具有多种优良特性,高活性抗菌肽的开发及其重组表达对解决菌株耐药性问题具有重要意义。【方法】根据牛乳铁蛋白素与天蚕素的结构,设计一种新型的杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素-天蚕素(LfcinB-Cecropin),根据Escherichia coli密码子偏爱性合成其编码基因,利用同尾酶法构建含有不同LfcinB-Cecropin基因片段拷贝数的重组表达载体,转化到E.coli BL21(DE3)进行重组表达。【结果】经IPTG诱导,LfcinB-Cecropin融合蛋白成功获得表达。经超声破碎、包涵体纯化、甲酸裂解后,获得具有明显抑菌活性的杂合肽LfcinB-Cecropin。【结论】获得一种高活性的新型抗菌肽LfcinB-Cecropin,并实现了在E.coli中的高效重组表达。