尼帕病毒F糖蛋白在重组牛痘病毒中的表达及鉴定

尼帕病毒(NiV)F蛋白在病毒侵入细胞和诱导中和抗体等方面具有重要作用。通过over-lapping PCR合成密码子优化的F蛋白基因构建了表达NiV F蛋白的重组牛痘病毒(WR株)rWR-NiV-F。利用兔抗NiV血清为检测抗体,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了F蛋白在重组病毒感染细胞中的表达。SDS-PAGE和Western blot检测证明重组蛋白F0被裂解为F1和F2。以rWR-NiV-F感染瞬时转染共表达NiV受体结合囊膜糖蛋白G的BHK细胞,可诱导细胞膜融合及合包体形成,证明该重组病毒表达F蛋白保持良好的抗原性及生物学活性,为NiV诊断及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础。

表达尼帕病毒G囊膜糖蛋白重组牛痘病毒的研究

采用牛痘病毒WR株,构建了表达哺乳动物密码子优化的NiV G蛋白基因的重组病毒rWR-NiV-G。Westernblot证实大小为66kDa的重组G蛋白在rWR-NiV-G感染的Hela细胞中获得表达;采用兔抗NiV高免血清间接免疫荧光检测重组痘病毒表达G蛋白显示出良好的特异免疫反应原性。rWR-NiV-G感染NiV敏感的BHK细胞系,并与NiV融合蛋白F共同表达,可形成强烈细胞融合现象。rWR-NiV-G感染免疫BALB/c小鼠,可诱导显著的NiV G蛋白特异体液免疫反应。以原核表达NiV G蛋白片段为包被抗原,间接ELISA检测rWR-NiV-G感染免疫小鼠血清中的G蛋白特异抗体,具有良好的敏感性和特异性。同时,rWR-NiV-G感染免疫小鼠血清中的G蛋白特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性。结果表明,重组牛痘病毒表达的NiV G蛋白有良好的免疫原性和生物学活性功能,为进一步深入研究NiV G蛋白生物学功能、免疫原性及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSVCH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5)。将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,与牛痘病毒进行同源重组。在含有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5)。IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSVGP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体。实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSV GP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。

禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达

目的研究H5 I151F和H5 I151F＋A134V＋E186D两种氨基酸变异对血凝素蛋白（HA）亲人受体结合的影响，并获得该HA。方法构建载体pRB21’，共感染／转染vp37^-牛痘病毒vRB12和pRB21’，基因同源重组牛痘病毒表达HA，Western免疫印迹法鉴定。结果获得了克隆有H5HA全长基因片段的载体pRB21’，构建了2种重组牛痘病毒re-VV H5 I151F和re-VV H5 I151F＋A134V＋E186D，且能在被感染细胞膜表达这两种HA。结论首次通过构建重组牛痘病毒成功表达了禽流感病毒H5N1的H5HA，为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性奠定了基础。

重组牛痘病毒疫苗对FMDV的保护作用

这种重组牛痘病毒可以表达口蹄疫病毒(FMDV)C3Arg85株4种结构蛋白的前体,其构成是使用一种基于蚀斑形成的方式分离重组牛痘病毒的步骤来设计并生成这种疫苗。成年鼠接种这一重组牛痘病毒之后,诱导了抗同源性FMDV和牛痘病毒的很高滴度的中和抗体,通过中和试验可测出。使用全部病毒作为抗原进行液相阻断夹心ELISA_s,能显示出很高的抗同源性FMDV的总抗体滴度。

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5重组牛痘病毒，本研究通过RT—PCR获得PRRSVCH—1a株GP5蛋白基因，将其克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后，将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中，构建重组转移质粒（pSC11—GP5）。将pSC11—GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞，

痘病毒疫苗载体

1798年 ,Jenner的发现奠定了免疫学的基础并最终导致天花病毒在地球上根除。尽管天花病毒已被消灭 ,在 2 0世纪 80年代仍引起一场研究痘苗病毒的高潮 ,其中部分原因是分子遗传学应用于对重组牛痘病毒外源基因的克隆和表达 ,而生物恐怖又重新引起人们对牛痘的关注。这些重组病毒在研究和疫苗学中均有多方面用途 ,并促进载体疫苗的发展 ,例如重组牛痘狂犬病疫苗在西欧及最近在美国被用来消除狂犬病 ;选择性的痘病毒载体 ,例如禽痘病毒用于非禽类动物时被证明是安全有效的非复制型载体。

用遗传工程痘病毒构建活重组疫苗

将适当的病原体基因通过体内重组,引入牛痘病毒基因组中,再将此活的重组牛痘病毒接种于人或动物,所产生的一些抗体不仅针对它本身的抗原,而且还针对插入的外源DNA顺序所规定的抗原。