犬腺病毒 1型疫苗株 E3缺失表达载体的构建

探索以犬腺病毒 1型疫苗株 (Cannaught Laboratory Limited, CLL)作为病毒重组疫苗和基因转移载体的可行性。方法构建带增强型绿色荧光蛋白（ enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因的 E3缺失重组病毒 CLLEGFP。将 CLLEGFP感染各种人源细胞，并以灌胃、腹腔注射、尾静脉注射和肌肉注射等不同途径接种昆明小鼠。多时间点取小鼠组织标本，冷冻干燥切片，观察 EGFP的表达。 4周后采集小鼠血清，以 Western blot分析抗 EGFP抗体的产生。结果 CLLEGFP能够感染各种人源细胞并表达 EGFP。在腹腔接种 CLLEGFP 3 d的小鼠肝组织细胞中可见转导的 EGFP。 Western blot分析显示，以各种途径免疫接种重组病毒 4周后的小鼠血清中均存在抗 EGFP特异抗体。结论 CLL具有开发成为病毒重组疫苗和基因转移载体的潜力。

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法 ,对HPV5 81L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰 ,并保留氨基酸不变。选用非复制型重组痘苗病毒为载体 ,将修饰的L1基因 1 5kb和L2基因 1 4kb分别插入痘苗病毒表达载体 pJSD的 7 5k和H6早期启动子之后 ,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组。经单斑筛选纯化 ,获得共表达HPV5 8L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株。该病毒在CEF细胞上连续传至第15代 ,经斑点杂交分析 ,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入 ;经Westernblot检测 ,重组病毒能稳定表达HPV5 81L1及L2蛋白。此结果为HPV5

Ⅱ型犬腺病毒自然弱毒YCA18株的实验免疫研究

应用 YCA1 8株第 8代细胞培养物 (YCA1 8- 8)经口鼻和静脉接种犬腺病毒 (CAV) SN抗体 <1∶ 2的易感犬作安全试验 ,结果未见任何 CAV临床症状与病理解剖学改变 ;用不同剂量的YCA1 8- 8分组免疫 CAV易感犬 ,经 SN抗体测定与用 CAV强毒攻击试验 ,结果 SN抗体达 1∶ 1 6以上的犬 95%以上可获得免疫保护 ,最低免疫量为 1 0 4 TCID50 ;应用 YCA1 8- 8分别免疫母源抗体达 1∶ 4和 1∶ 8的两组试验犬 ,第一次免疫 1 4d后 SN抗体均未有升高 ,追加 2～ 3次免疫后 SN抗体才逐渐上升至 1∶ 1 6以上的免疫保护水平 ;用 CAV易感犬和 MDCK分别将 YCA1 8连续传 8代和 2 0代 ,结果对犬仍然安全 ,对犬的免疫原性未见下降 ,最低免疫量仍为 1 0 4 TCID50 ;与 CDV和CPV弱毒作免疫互扰试验 ,结果与各弱毒的单独免疫结果未见差异 ;将 YCA1 8- 8冰冻保存于 -30℃ ,6个月内 TCID50 仍不低于 1 0 -4 /0 .1 ml,经加明胶 -蔗糖低温真空冻干后 ,4℃和 - 30℃保存 1年 ,TCID50 均仍维持在 1 0 -4 /0 .1 ml以上 ;经 YCA1 8- 2 0 3次免疫的试验犬 ,1年后 SN抗体仍在最低抗体保护值 1∶ 1 6以上。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因,继而构建出真核表达载体pVAX-VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上,筛选出VP1表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子,获得转移载体。再经酶切,连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞,转染3次后,细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定,证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2/FMDV。经验证,该重组毒可稳定遗传,其毒价为103.5TCID50/mL。

表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组犬2型腺病毒的构建及其免疫原性研究

为研制 1种以犬 2型腺病毒为载体的狂犬病疫苗 ,以狂犬病病毒SRV9株基因组为模板 ,通过RT_PCR技术扩增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外区序列 ;以其为目的基因构建以CMV为启动子、SV4 0polyA为终止信号的表达盒。将犬 2型腺病毒的E3区克隆入中间质粒中 ,然后对其进行部分缺失 ,并将表达盒克隆入缺失处 ,再以此重组的E3区置换犬 2型腺病毒的E3区。以重组的犬 2型腺病毒基因组转染MDCK细胞 ,最终获得了表达盒分正向和反向插入E3区的重组犬 2型腺病毒。用两株重组腺病毒免疫幼犬 ,均在犬体内产生了针对狂犬病病毒的抗体。

犬腺病毒Ⅰ型流行毒株的分离与鉴定

目的 分离、鉴定犬腺病毒 型流行毒株 .方法 将处理过的病犬肝组织悬液 ,感染原代犬胎肾细胞 .用血凝试验、中和试验、回归试验以及电镜观察等方法 ,分离、鉴定 .结果 分离出一株犬腺病毒 型流行毒株 ,命名为 CAV1 -XN3株 .

CVB3VP1核酸疫苗与重组腺病毒Ad/VP1联合应用的免疫效果

目的:观察柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus group B type 3,CVB3)VP1核酸疫苗pcDNA3/VP1与重组腺病毒Ad/VP1联合应用的免疫效果。方法:大量制备pcDNA3/VP1和Ad/VP1,肌肉注射免疫小鼠。4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组:质粒组,注射pcDNA3/VP1,共3次;腺病毒组,注射Ad/VP1,共2次;质粒/腺病毒组,第1、2次注射pcDNA3/VP1,第3次注射Ad/VP1;PBS对照组。各次注射间隔时间为3周。质粒每次接种100μg/只,腺病毒每次接种4×107pfu/只。用微量中和试验和ELISA法分别检测每次免疫后血清中和抗体和IgG抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性;用致死量病毒感染后检测血中病毒滴度,并观察小鼠的生存情况。结果:各实验组小鼠的中和抗体和IgG抗体水平均随免疫次数增加而提高,末次免疫后,质粒/腺病毒组血清中和抗体和特异性IgG抗体滴度(31.70±1.41,2425.15±1.86)明显高于质粒组(23.78±1.37,918.96±1.36)和腺病毒组(18.88±1.22,800.00±1.63)(P<0.05);各实验组淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性高于PBS对照组(P<0.05);以致死量病毒感染后,质粒/腺病毒组血清病毒滴度低于其他组(P<0.05),生存率高于其他组(P<0.05)。结论:核酸疫苗与重组腺病毒联合应用可以明显提高免疫效果。

犬2型腺病毒E1转化细胞系的特性研究

对筛选到的一株CAV-2 E1转化细胞(DK/E1)进行了初步的特性研究。以DK细胞为对照,观察到转化细胞的形态与DK细胞有明显区别,细胞变长,易聚集生长。通过测定DK及DK/E1细胞分别在2％、5％和10％牛血清培养基中的生长曲线,结果发现DK/E1细胞的生长速度比DK细胞快。用蚀斑和TCID50测定了病毒在DK和DK/E1细胞上的病毒滴度,结果表明DK/E1细胞产生的病毒蚀斑比DK细胞的大,TCID50测得的病毒滴度比DK细胞产生的病毒滴度高。CAV-2全基因组DNA对DK/E1细胞和DK细胞的转染试验结果表明,5μg和10μg的CAV-2DNA转染的DK/E1细胞,分别在转染后第14天和第11天均出现了典型的腺病毒细胞病变,而相同量CAV-2 DNA转染的DK细胞未出现病变,说明DK/E1细胞有助于CAV-2 DNA的复制和病毒粒子的包装。在DK/E1细胞内的重组试验表明,DK/E1细胞也有利于重组病毒的产生。以上转化特性在DK/E1细胞传至80代时仍保持不变,说明本试验获得了一株CAV-2 E1基因的转化细胞系。

感染性犬2型腺病毒全基因组克隆及鉴定

以犬 2型腺病毒 (canine adenovirus type- 2 ,CAV- 2 )自然弱毒株 YCA18基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增分别获得其双链两末端 10 13bp(U)和 972 bp(D)的 DNA序列 ,以首尾相接方式克隆入载体 p Poly2 ,获得重组质粒p Poly2 - UD。以 Hind 和 Bst B 双酶切 p Poly2 - UD,回收含载体和部分 U、D的大片段并与 CAV- 2 DNA共转化感受态 E.coli Sure TM,经菌体内同源重组 ,获得含有 CAV- 2全基因组序列的重组质粒 p Poly2 - CAV- 2。后者以 Cla 和 Asc 双酶切 ,释放 CAV- 2全基因组 ,通过脂质体介导转染 MDCK细胞 ,盲传 3代后重复转染 1次 ,4d后 ,出现腺病毒典型病变。细胞上清血凝效价为 1∶ 6 40 ,并可被 CAV- 2抗血清有效抑制。以上结果表明 ,本研究获得了具有感染性的CAV- 2全基因组重组质粒 ,为以 CAV- 2作为重组疫苗载体的系列研究奠定了重要基础。

犬腺病毒DNA疫苗的免疫实验研究

目的研究犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop刺激机体产生免疫应答的效果。方法采用2种不同的免疫途径和免疫方案免疫Balb/c小鼠;免疫后每周断尾采血,分离血清测定血清IgG抗体效价;采用MTT和CCK-8方法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖活性,EIA试剂盒测定IFN-γ的浓度。结果所有接种DNA疫苗的小鼠均产生了针对抗原病毒的特异性IgG抗体。细胞学试验提示构建的犬腺病毒DNA疫苗也可诱导小鼠产生细胞性免疫应答,重组质粒-蛋白联合的免疫方案在刺激机体细胞免疫应答方面优于单一重组质粒。结论以上结果提示犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop既能诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答,也诱导小鼠产生了细胞免疫应答,对于机体具有一定的免疫保护效果。

犬腺病毒2型载体及其应用的研究进展

犬腺病毒2型也称犬传染性喉气管炎病毒,可诱导宿主产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。将外源基因插入犬腺病毒2型早期转录区后可诱导宿主产生低水平的先天免疫,且能够在宿主体内安全、持续、稳定地表达外源基因,为基因转移提供了条件。犬腺病毒2型载体具有安全性和稳定性高、抗原表达能力强、易于进行各种遗传改造操作和携带大片段的外源基因等特点,是目前作为动物疫苗与基因治疗最有发展前景的非人类腺病毒载体之一。犬腺病毒2型载体已经广泛应用于动物疫苗研制、基因治疗等多个生物医学领域。笔者就犬腺病毒2型的分子生物学特性及犬腺病毒2型载体的发展、构建方式及在动物疫苗研制和基因治疗中的应用进行综述,旨在进一步挖掘犬腺病毒2型载体在基因治疗、动物疫苗研制中的作用,以及为下一代犬腺病毒2型载体平台的建设提供理论基础。

埃博拉腺病毒-5载体重组疫苗在中国健康成人中的安全性和免疫原性

到目前为止,所有用于试验的埃博拉病毒疫苗都是基于1976年扎伊尔暴发的病毒株。这里,作者旨在评估表达2014病毒流行株糖蛋白的基于腺病毒-5的新型重组型埃博拉载体疫苗的安全性及免疫原性。这项随机、双盲、安慰剂对照的一期临床试验在中国江苏省台州县开展。年龄18~60岁的健康成人被列入试验对象并用计算机生成的随机化区组（区组大小为6）进行随机化分组（2∶1）,

疫苗保护小鼠免遣多种H5N1型禽流感病毒侵袭

据Medscape．com 2月1日报道（原载Lancet 2006），美国研究者已经研制了一种依赖腺病毒载体的疫苗可用来有效地预防禽流感，与过去的同类疫苗相比，它具有多种优点，包括易于大规模生产和可针对不同抗原型的H5N1禽流感病毒株产生保护功效。对高致病性H5N1型禽流感病毒在人与人之间传播可能会造成流感大流行的惧怕反而刺激了人们努力去研制一种新的预防此病毒的疫苗。以前的此类疫苗都是依赖受精鸡胚生产的减毒疫苗。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白-重组犬1型腺病毒构建及在猪体内免疫特性

本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因组GP5蛋白的免疫原性，将PRRSV河北分离株GP5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内，转染MDCK细胞，获得了重组病毒，免疫新生仔猪，分别在免疫后O～12周采集血清，通过ELISA检测证明，猪体同时产生了针对犬1型腺病毒和PRRSV GP5的抗体。说明GP5-重组犬1型腺病毒具有作为蓝耳病疫苗的潜力。

辽宁省首次从急性弛缓性麻痹(AFP)病例分离的一株人腺病毒1型重组株的全基因组序列特征分析

人腺病毒(Human mastadenoviruses,HAdV)是一种常见的病毒病原体,在儿科患者中普遍存在。本研究首次报道了2017年从辽宁省急性弛缓性麻痹(AFP)病例的粪便标本中分离到的一株人腺病毒1型重组株LN2017,并对其全基因组进行测序和分析。我们首先测定了LN2017的全基因组序列,并将其与从GenBank数据库中下载的来自8个国家的38个参考株一起,构建了基于全基因组、Hexon基因,Penton base基因,Fiber基因和E3基因的系统发育树,并用RDP4.97和SimPlot3.5.1软件进行了重组分析。结果显示,LN2017病毒为HAdV-C亚属,其Hexon,Penton base和Fiber基因与HAdV-1高度相似,但是其E3基因和HAdV-2、HAdV-6高度相似。重组分析显示毒株LN2017是一个重组病毒,在E3基因区域和HAdV-2发生了重组,重组区域位于28045-31042。本研究首次证实了LN2017与GenBank中的JX173080(埃及株E13)、MH183293(上海株SH2016)和MH121110(德国株43C1)具有相同的重组方式,在HAdV-1内构成一个独立的分支。未来,有必要对该分支人腺病毒1型重组株的致病性和临床特征进行进一步研究,并继续加强对HAdV的分子流行病学监测。

HIV-1 gagpol重组腺病毒疫苗的构建及其免疫原性的研究

目的:构建HIV-1重组腺病毒疫苗并初步鉴定其免疫原性。方法:用Adeno-X Expression System试剂盒将HIV-1 gagpol基因片段插入到腺病毒载体上,通过脂质体介导将获得的重组腺病毒质粒Adeno-X-gagpol转染至293细胞,使之自主包装成有感染活性的重组腺病毒rAd-gagpol,用western-blotting法鉴定其表达情况;用CsCl密度梯度离心法纯化该重组腺病毒,以5×108pfu/mL的滴度1 mL单次免疫小鼠,15天后测小鼠体液免疫效果。结果:克隆序列与设计相符,重组腺病毒疫苗能稳定表达gagpol蛋白,体液免疫中检测出抗p55和p24的特异性抗体。结论:HIV-1 gagpol重组腺病毒构建成功,具有一定的体液免疫原性。

HIV DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫效果的研究

目的 构建含HIV 1B亚型中国株gagV3基因的DNA疫苗及重组腺病毒伴随病毒(rAAV)疫苗 ,并研究DNA疫苗和rAAV联合免疫的免疫效果。方法 将HIV 1B亚型中国株gagV3基因克隆入真核表达载体pCI neo上 ,构建了含HIV 1gagV3基因的DNA疫苗pCI gagV3。采用电击法将pCI gagV3质粒转染p815细胞 ,用G4 18压力筛选 ,得到转入重组质粒的细胞系p815 gagV3,用免疫酶法检测细胞系中HIV 1基因的表达。用该DNA疫苗进行小鼠免疫实验 ,检测免疫效果 ;用该DNA疫苗初次免疫 ,含同样gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒rAAV gagV3加强免疫 ,采用免疫酶法检测免疫小鼠血清中HIV 1特异性的抗体水平 ,用乳酸脱氢酶法检测免疫小鼠的HIV 1特异性CTL水平。结果 pCI gagV3可以在p815细胞中表达HIV 1的基因 ,免疫BALB c小鼠后可以在小鼠体内诱发HIV 1特异性的细胞和体液免疫反应。HIV 1特异性抗体滴度为 1∶2 0 ;效靶比为 5 0∶1时 ,CTL平均杀伤率为4 1 7%。pCI gagV3与rAAV gagV3联合免疫并不能明显提高抗体水平 ,但可以提高CTL反应 ,效靶比为 5 0∶1时 ,CTL平均杀伤率为 6 1 3% ,高于单独用DNA疫苗或重组AAV疫苗免疫后产生的CTL活性。结论 DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫可以提高免疫小鼠产生的HIV 1特异性CTL反应。

流感候选疫苗可对小鼠提供广泛保护作用

1项临床前攻击研究表明，由甲型流感病毒4个进化枝的祖先基因制成的腺病毒载体疫苗对动物具有保护作用。接种该候选疫苗的小鼠在接受HINl、H3N1、H3N2和H5N1毒株感染后均存活，其中接种较大剂量的小鼠没有出现任何疾病症状。相反，接种传统鼻喷雾疫苗的小鼠在感染后死亡。