定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的:建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体(HuMabs)NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法:采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabs NM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果:间接ELISA法检测HuMabs NM57的灵敏度为5ng/mL,组内及组间精密度分别为2.6%～6.0%、8.5%～11.3%。结论:建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabs NM57的检测。

N-糖链切除对重组抗狂犬病毒单克隆抗体中和活性的影响

重组抗狂犬病毒单克隆抗体是一种全人源的抗病毒感染单抗,主要用于狂犬病毒暴露后预防。采用糖苷酶处理2种重组抗狂犬病毒单克隆抗体Mab1、Mab2水解切除N-糖链,通过糖染色和毛细管电泳检测确定N-糖链酶解程度,利用快速荧光灶抑制试验检测其中和活性,分析N-糖链切除对该单抗中和活性的影响。结果显示,N-糖链切除后抗体中和活性无明显变化。说明N-糖链对这两株抗狂犬病毒单抗的体外中和活性不是必须的结构成分。

人源抗狂犬病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面呈现 (phagedisplay)技术获得了人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程单克隆抗体Fab段基因及其表达。从狂犬病毒PM株Vero细胞疫苗免疫的人抗凝血中分离获得外周淋巴细胞 ,提取细胞总RNA ,通过RT -PCR方法 ,用一组人IgGFab基因特异性引物 ,从合成的cDNA中扩增了一组轻链和重链Fab段基因 ,将轻链和重链先后克隆入噬菌体载体 pComb3,成功地建立了抗狂犬病毒噬菌体抗体库 ,并用纯化的狂犬病毒颗粒和几株抗狂犬病毒鼠单克隆抗体 (单抗 )捕捉狂犬病毒抗原的方法 ,对此抗体库进行富积筛选表达 ,成功地获得了抗狂犬病毒的人源单抗Fab段基因及其在大肠杆菌中的有效表达。对其中一株单抗G10进行了较为系统的分析 ,发现它与一株鼠源中和性狂犬病毒糖蛋白特异性单抗存在竞争 ,证实该单抗能识别狂犬病毒糖蛋白。其序列资料分析表明 。

重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效及骨保护的影响

目的:观察重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效、骨保护的影响,为类风湿关节炎治疗提供更多、更积极手段。方法:选取2019年9月—2020年9月萍乡市人民医院门诊及住院就诊、确诊类风湿关节炎患者120例,按照随机数字表法分组,分为对照组和观察组。对照组为安慰剂(淀粉)+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松≤10 mg/d;观察组为重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体注射液+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松≤10 mg/d,对比疗效、关节肿胀、关节压痛、骨密度、骨钙素等成果。结果:治疗3个月后,观察组的临床总有效率高于对照组(P<0.05),红细胞沉降率、类风湿因子均低于对照组(P<0.05),观察组骨密度T值、骨钙素均优于对照组(P<0.05)。观察组关节肿胀、关节压痛个数均少于对照组,观察组VAS评分及DAS28均低于对照组(P<0.05)。在治疗期间不良反应发生率上,观察组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在甲氨蝶呤及稳定剂量泼尼松≤10 mg/d基础上,采用重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体对类风湿关节炎具有良好的临床疗效,还有助于改善骨保护、骨密度指标,同时不良反应较少。

重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体对类风湿关节炎临床疗效及骨代谢的影响

目的:探讨重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体对类风湿关节炎(RA)临床疗效及骨代谢的影响。方法:选取2019年8月—2022年3月于萍乡市人民医院就诊并确诊RA患者60例,按随机数字表法将患者分为治疗组和对照组,各30例。治疗组采用重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体+甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松治疗,对照组采用甲氨蝶呤+稳定剂量泼尼松治疗。于治疗前和治疗3、6个月检测两组患者机体的C反应蛋白、类风湿因子、血沉、骨钙素(OC)、骨密度,评估两组患者的视觉模拟评分法(VAS)评分、Sharp评分及安全性。结果:两组治疗3、6个月的C反应蛋白、类风湿因子、血沉、VAS评分均明显低于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月上述指标均明显低于对照组(P<0.05)。两组治疗3、6个月的OC均高于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月OC均高于对照组(P<0.05);两组治疗前后股骨颈骨密度组间和组内比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。两组治疗3、6个月的Sharp评分均低于治疗前(P<0.05),且治疗组治疗3、6个月的Sharp评分均低于对照组(P<0.05)。治疗组不良事件发生率虽高于对照组,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:重组人源化抗白介素-6受体单克隆抗体可有效降低RA患者的C反应蛋白、类风湿因子及血沉水平,缓解其疼痛,升高OC,降低Sharp评分,且不会增加不良事件的发生,安全性较高。

重组抗IgE人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效

目的通过检测肺功能来评价重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中Ig E水平,每2 w或4 w给予Ig E抗体皮下注射,检测患者肺功能(FVC、FEV1、FEV1/FVC%、MMEF75/25),评价重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗支气管哮喘急性发作期的疗效。结果治疗后FVC、FEV1、FEV1/FVC%,MMEF75/25较治疗前比较差异显著(P<0.05),三组间无差异(P>0.05)。结论重组抗Ig E人源化单克隆抗体治疗轻中重支气管哮喘急性发作期均有效,但轻、中、重度急性治疗效果三组间无明显差异。

重组抗CD25人源化单克隆抗体治疗激素耐药急性移植物抗宿主病的临床研究

本研究探讨重组抗CD25人源化单克隆抗体在异基因造血干细胞移植后激素耐药的急性移植物抗宿主病(aGVHD)防治中的作用。对21例异基因造血干细胞移植后出现耐激素的Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的患者于第1、4、8 d给予重组抗CD25人源化单克隆抗体1 mg/(kg·d)静脉输注,未达到疗效的病人间隔1周后重复本治疗。结果表明,所有患者中完全有效13例(61.9%),其中4例无病生存,8例生存伴轻度慢性移植物抗宿主病(cGVHD),1例死于白血病髓外复发;6例部分有效(28.57%),其中3例生存伴轻度cGVHD,3例死于肺部感染;2例无效(9.52%)死亡;总有效率90.5%,总生存率71.48%,尤其在单倍体造血衰竭性疾病的6例患者中,有效率高达100%。该药应用安全,未发现输注相关的毒副作用。结论:重组抗CD25人源化单克隆抗体对异基因造血干细胞移植后激素耐药的Ⅱ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病(aGVHD)有较好的疗效,且应用安全。

重组抗HER2人源化单克隆抗体大规模制备及活性鉴定方法学建立

目的建立大规模表达重组人源化HER2单克隆抗体(Anti-her2)并测定重组抗体活性的方法。方法利用Anti-her2重链、轻链真核表达载体质粒共同转化CHO细胞,筛选稳定表达株,然后放大培养,并利用Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、HPLC检测产物纯度,Western blot检测产物特异性,同时比较重组抗体的活性。结果筛选得到1株稳定表达的细胞株,收液后蛋白BCA定量为135.9 mg·L-1。纯化后获得的目的蛋白相对分子质量约为185 kD,蛋白纯度在99%以上,与商品化的“赫赛汀”一致;活性检测显示其活性与“赫赛汀”相当,细胞实验揭示其能显著抑制BT-474细胞增殖及胞内HER2的表达。结论该方法筛选获得的重组蛋白,与商品化药物性质基本一致,这为重组抗体药物的大规模悬浮培养放大和工业化生产奠定了基础。

间接ELISA法测定猕猴血清中重组人源化抗EGFR单克隆抗体的含量

目的建立猕猴血清中重组人源化抗EGFR单克隆抗体的测定方法,为药代动力学研究提供简单快速的方法。方法采用EGFR包外区包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测抗EGFR单克隆抗体的间接ELISA法,并对其特异性、精密度、准确度、稳定性和稀释效应进行确证。结果在0.46～14.56ng·mL-1浓度范围内,测定方法具有较好的logistic曲线拟合关系,最低检测限为0.46ng·mL-1,组内及组间精密度的RSD分别为6.10%～9.81%,10.17%～11.93%。结论该方法简便、准确、特异性强,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中抗EGFR单克隆抗体的检测。

中国首个基因重组人源化单克隆抗体药物上市

在“十五”、“十一五”国家高技术研究发展计划（863计划）连续支持下，经过8年努力，2008年7月，中国第1个基因重组人源化单克隆抗体药物——泰欣生（尼妥珠单抗），获得国家药监局的新药证书、生产批文和GMP认证，近日成功上市。

定量检测重组抗白介素6受体人源化单克隆抗体HS628的ELISA方法的建立及确证

目的：建立一种灵敏、特异、快速、经济的ELISA方法,用于检测食蟹猴血清中重组抗白介素6受体人源化单克隆抗体HS628的含量。方法：对ELISA与生物素-亲和素ELISA（BA-ELISA）方法进行比较,最终采用BA-ELISA法对HS628进行定量。包被抗体为羊抗人Ig G单抗,以生物素标记的重组白介素6受体作为检测抗原,以HRP标记的链霉亲和素作为放大剂,最终用单组分显色液（TMB）显色。结果：建立了特异性检测HS628的ELISA方法并完成方法学确证,该方法的线性范围为1.64~400 ng/m L,灵敏度为1.64 ng/m L,精密度、准确度、回收率及稳定性符合要求,与对照品校正标准曲线吻合。结论：用建立的ELISA方法测定猴血清中HS628的含量能满足新生物制药临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于HS628的检测。

重组抗VEGF人源化单克隆抗体F0001的临床前主要药效学研究

目的:评估重组抗VEGF人源化单克隆抗体F0001的临床前主要药效学及与原研药安维汀的生物类似性。方法:从体外作用机制及活性、体内抑瘤作用、及对荷瘤小鼠PK/PD等方面进行研究。结果:F0001明显抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化;抑制HUVEC细胞增殖,IC50为123ng/ml。F00015mg/kg显著抑制人结肠癌Ls-174t、肺癌NCI-H460和恶性胶质瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤生长,抑瘤率分别为68%、68%和86%;与化疗药CPT-11合用对人结肠癌Ls-174t有抑瘤增效作用,抑瘤率提高到89%。F0001与安维汀体外作用机制及活性相当、体内抑瘤效果相当,二者在人结肠癌Ls-174t荷瘤小鼠体内PK/PD参数相似。结论:F0001与原研药安维汀在主要药效学方面高度类似。

重组人源化双功能单克隆抗体致细胞因子释放综合征1例

双特异性抗体现已成为肿瘤免疫治疗药物的热点,而其诱发的与免疫相关的细胞因子释放综合征(CRS)可能危及生命,已成为当前关注的焦点。我院Ⅰ期临床试验1例乳腺癌患者,首次输注重组人源化双功能单克隆抗体MBS301在11 min后出现胸闷、气急渐加重、周身湿冷、血氧下降等症状,考虑为CRS。予以甲泼尼龙琥珀酸钠抗炎,哌拉西林钠舒巴坦钠及利奈唑胺抗感染、化痰等对症治疗,患者症状好转。及时应用糖皮质激素可以治疗双特异性单克隆抗体引起的CRS。

重组人源化抗PD-1单克隆抗体注射液Ⅰ期临床试验的综合护理对策

分析12例PD-1受试者的临床资料,结合国内外文献,分享和讨论临床试验工作中使用PD-1患者的护理经验与体会。

丽珠医药“重组全人源抗OX40单克隆抗体注射液”临床试验申请获国家药监局受理

近日,丽珠医药公告称,其控股附属公司珠海市丽珠单抗生物技术有限公司申报的"重组全人源抗OX40单克隆抗体注射液"临床试验申请获国家药监局受理。据悉"重组全人源抗OX40单克隆抗体注射液"历经2年研发,临床试验申请已于2019年3月12日获得受理。截至目前,包括丽珠单抗在内,国内以"OX40"为靶点的单抗药物仅有2家提出临床申请,其中1家已获批临床。

人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体的构建及烟草转基因研究

为了构建高效表达人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体,首先对人源抗狂犬病毒抗体(SO57)重链和轻链编码基因的密码子进行偏好性改造,添加增强外源基因表达的控制元件,然后分别与花椰菜花叶病毒35s启动子和木薯叶脉花叶病毒启动子融合,连接至植物表达载体pBI121上,然后将构建好的载体转入农杆菌LB4404,采用叶盘法转化烟草叶片。用分子生物学技术,对6株转基因烟草进行检测,电泳检测结果均为阳性。用酶联接免疫吸附剂法,检测6株烟草叶片中人源抗狂犬病毒单克隆抗体的表达。结果表明,6株烟草均成功表达人源抗狂犬病毒抗体。

重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的质控方法及质量标准的建立

目的建立重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(rhRMcAb)的质控方法和质量标准。方法采用小鼠中和试验(MNT)和快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分别测定6批rhRMcAb样品的中和活性;还原、非还原SDS-PAGE检测rhRMcAb样品的纯度;还原烷基化胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法分析rhRMcAb的肽图;焦谷氨酸肽酶去除N-端焦谷氨酸封闭后,氨基酸序列分析仪测定rhRMcAb的N-端氨基酸序列;表面等离子共振法(Surface plasmon resonance,SPR)测定rhRMcAb与狂犬病病毒糖蛋白的亲和常数;按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhRMcAb的各项其他指标,并建立其质量标准。结果采用MNT和RFFIT2种方法检测6批rhRMcAb的中和活性,批间活性基本一致;3批rhRMcAb原液的还原SDS-PAGE纯度大于99.0%,非还原SDS-PAGE除抗体主带外,在高、低相对分子质量处分别存在一些次带;3批原液样品的肽图图谱与理化测定对照品一致;N-端氨基酸序列与理论序列一致;结合狂犬病病毒糖蛋白抗原的亲和常数为1.86×108/M;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求;建立的质量标准中,中和活性应不低于500IU/mg,SDS-PAGE及HPLC纯度应不低于98.0%。结论已建立了rhRMcAb的质控方法和质量标准,可用于rhRMcAb产品的检定。

治疗性单克隆抗体的市场现状及展望

继重组蛋白获得商业成功之后,治疗性单克隆抗体(单抗)的开发研制正成为生物技术工业的第二次创新高潮.2002年全球治疗性单抗市场较2001年增长37%,达到了54亿美元.其中嵌合型单克隆抗体占有绝对领先地位,其年增长率高达43%,销售额为38亿美元;其次是人源化单克隆抗体,其销售额超过14亿美元,年增长率约29%.目前,正在开发的治疗性单抗有132个,估计其中有16个产品能在2004年～2008年间获得批准.而随着治疗性单抗现有产品销售额的持续增长及又一轮新产品的集中上市,预计在2008年治疗性单抗的全球市场销售额可达近167亿美元,为2002年的3倍.

重组抗CD25人源化单克隆抗体挽救性治疗糖皮质激素耐药型急性移植物抗宿主病64例疗效分析

目的分析重组抗CD25人源化单克隆抗体(人源化CD25单抗)治疗异基因造血干细胞移植后糖皮质激素耐药型急性移植物抗宿主病(SR-aGVHD)的疗效。方法纳入2019年6月至2020年10月在苏州弘慈血液病医院接受人源化CD25单抗治疗的64例异基因造血干细胞移植后SR-aGVHD患者,所有患者予人源化CD25单抗1 mg·kg^(-1)·d^(-1)第1、3、8天各1次,此后根据病情每周1次。在人源化CD25单抗治疗后第7、14、28天进行疗效评估。结果64例患者中男38例(59.4%),女26例(40.6%),中位年龄31(15~63)岁。64例SR-aGVHD患者人源化CD25单抗治疗后第7、14、28天有效率分别为48.4%(31/64)、53.1%(34/64)、79.7%(51/64)。肝脏受累是人源化CD25单抗治疗SR-aGVHD第28天疗效不佳的独立危险因素(OR=9.588,95%CI 0.004~0.291,P=0.002)。从人源化CD25单抗治疗开始随访,所有患者的中位随访时间为17.1(0.2~50.8)个月。治疗后12、24个月总生存率分别为63.2%(95%CI 57.1%~69.3%)、52.6%(95%CI 46.1%~59.1%),无病生存率分别为58.4%(95%CI 52.1%~64.7%)、49.8%(95%CI 43.4%~56.2%),非复发死亡率分别为28.8%(95%CI 23.1%~34.5%)、32.9%(95%CI 26.8%~39.0%)。多因素分析结果显示,肝脏受累(OR=0.308,95%CI 0.108~0.876,P=0.027)和Ⅲ/Ⅵ度aGVHD(OR=9.438,95%CI 1.211~73.577,P=0.032)是影响移植后总生存的独立危险因素。结论人源化CD25单抗对于异基因造血干细胞移植后SR-aGVHD有较好的疗效。