重组猪干扰素α1冻干粉针剂在猪体内的药代动力学研究

为研究重组猪干扰素α1(rPoIFN-α1)冻干粉针剂在猪体内的药代动力学特征,本研究将实验猪随机分为3组:分别静脉、肌肉和皮下注射rPoIFN-α1 1.0×107IU,每组设立对照组,于注射后间隔不同时间采血,采用细胞病变抑制法测定其血清样品中rPoIFN-α1的效价。结果表明,肌肉注射组和皮下注射组药动学特征符合一室开放模型,呈一级动力学消除,血药峰时间(Tmax)分别为2.872±0.314 h和4.000±0.539 h,消除半衰期(T1/2)分别为6.236±0.551 h和6.644±0.751 h,血药峰浓度(Cmax)分别为3.980±2.875×104IU/L和1.080±0.986×104IU/L。静脉注射组符合二室开放模型,呈一级动力学消除,分布半衰期(T1/2α)为0.136±0.021 h,消除半衰期(T1/2β)为5.195±0.351 h,Cmax值为6.380±0.546×104IU/L。rPoIFN-α1静脉、肌肉和皮下注射组清除率分别为0.930±0.132 L/h、0.677±0.228 L/h和0.879±0.210 L/h。与静脉注射组相比,肌肉注射组的生物利用度为47.82%,皮下注射组的生物利用度为35.09%。本实验结果提示这3种rPoIFN-α1的注射方法在猪体内吸收、消除较快,具有线性动力学特征。rPoIFN-α1肌肉注射给药的生物利用度高于皮下注射组,消除半衰期比静脉注射组延长,可以作为替代静脉注射的一种方便和安全给药途径。

重组猪干扰素α对急性病毒性腹泻仔猪肾脏损伤的保护作用研究

为研究重组猪干扰素α(rPoIFNα)在人工感染仔猪病毒性腹泻模型上对肾脏损伤的保护作用,选取10日龄健康三元哺乳仔猪15头,随机分为rPoIFNα治疗组(使用剂量100万单位/头)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染对照组和正常对照组,每组5头仔猪。rPoIFNα治疗组和感染对照组仔猪经口饲喂PEDV悬液4 mL(接种量为4.0×105.5 TCID50/头),正常对照组仔猪同步饲喂4 mL生理盐水,建立PEDV致哺乳仔猪病毒性腹泻模型。模型建立结果显示,攻毒后72 h,感染对照组仔猪全部出现腹泻、脱水等典型病毒性腹泻症状,仔猪小肠及肾脏病料组织的PEDV核酸检测为阳性。同时发现,该组仔猪血肌酐水平显著升高(P<0.05),尿比重较其他两组偏高,并检测出颗粒管型和尿蛋白。镜下HE染色病理学观察到肾间质组织中出现嗜酸性粒细胞,提示超敏反应参与对肾脏的损伤。rPoIFNα治疗组仔猪症状轻微且易恢复,PEDV核酸检测阳性率仅为30%。仔猪相关血液及病料组织样本检测结果显示,rPoIFNα对PEDV感染仔猪治疗有效率达到60%。试验表明,rPoIFNα可有效治疗PEDV感染引起的仔猪腹泻,同时对肾脏具有明显保护作用。

重组猪干扰素α1冻干粉针剂对猪的安全性试验研究

试验旨在观察自行研制的重组猪干扰素α1冻干粉针剂对猪的安全性。将20头健康仔猪随机分为4组(3组试验组和1组对照组),每组5只,3组试验组分别肌肉注射低、中和高剂量重组猪干扰素α1冻干粉针剂,连续注射7d,对照组同时肌肉注射生理盐水。对动物基本生命体征、血常规、血液生化指标、组织标本病理学指标进行观察。各试验组仔猪的外表及行为特征均正常;体温、体重的变化也在正常范围之内;重要脏器如脑、肺脏、肝脏、心脏和脾脏病理解剖HE染色结果显示无器质性病变发生;血常规、血液生化指标均正常。试验结果表明本项目研制的重组猪干扰素α1冻干粉针剂对仔猪无明显毒副作用,使用安全。

重组猪干扰素α6在毕赤酵母中表达及其活性研究

为获得稳定表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母。人工合成Po IFN-α6基因片段,连接至pPICZαA质粒,构建PoIFN-α6毕赤酵母表达质粒pPICZαA-PoIFNα6;经Sac I酶线性化后转化至毕赤酵母X33感受态细胞,筛选阳性克隆;优化毕赤酵母表达条件,并对表达产物进行了体外抗病毒活性测定。结果表明,成功构建了表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母,以1%甲醇诱导72 h后,菌体上清SDS-PAGE可见20 kDa左右目的条带,Western blot检测为阳性;表达的重组猪干扰素α活性在PRRSV/Marc-145、VSV/MDBK、PRV/Vero、PEDV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15和TGEV/PK-15系统中均具有良好的抗病毒活性。说明PoIFN-α6在细胞上清中表达成功,并且在不同宿主细胞中均有抗病毒活性。

重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性,同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;之后通过小鼠攻毒保护试验,测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量,ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化,并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示,成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10^(6)IU,对细胞没有损害作用,且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平;在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖,减少促炎因子的产生,延缓临床症状的出现。结果表明,原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。

应用RP-HPLC法检测重组猪干扰素α成品蛋白含量

目的：建立测定重组猪干扰素α成品中蛋白含量的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）,并进行验证。方法：应用RP-HPLC法测定重组猪干扰素α标准品及供试品的蛋白含量,并对方法的线性、精密度、稳定性、重复性进行验证。采用已建立的RP-HPLC检测方法测定7批重组猪干扰素α样品的蛋白含量,与Lowry法的检测结果进行比较。结果：重组猪干扰素α在6.141 7-25μg范围内,与峰面积呈现良好的线性关系（R2=0.985 9）。用所建立的方法测定同一标准品,进样6次,计算得到RSD（相对标准偏差）为1.7%;同一批样品进样12次,检测供试品的干扰素α蛋白含量,计算得到RSD为3.9%;同一批样品,取6份分别进样,检测供试品的干扰素α蛋白含量,计算得到RSD为0.9%。结论：建立了用RP-HPLC法测定重组猪干扰素α蛋白含量的方法。该方法简便、精密度、稳定性、重复性好,将蛋白分离成单一组分峰,紫外定量测定各峰吸光度,集定量与定性、纯度检验合一,定量范围可小于10μg,测定体积只需几微升,可用于重组猪干扰素α成品蛋白含量检测。

重组猪α干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达

用巨引物PCR法介导的定点突变把猪α干扰素 (PoIFN α)第 86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC) ,同时将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC ,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEX IFN ,表达产物占菌体总蛋白的 2 0 %。将以包涵体形式表达的目的蛋白经变、复性处理 ,并以FPLC进一步纯化 ,得到了具有较高生物活性的产物 (5 2 0 0IU mg)。

重组猪γ干扰素对仔猪外周血T淋巴细胞亚群及IL-2、IFN-γ水平影响的研究

选28日龄健康仔猪16头,随机分为4组。1组为对照组,肌肉注射生理盐水;2-4组为试验组,分别肌注重组猪IFN-γ注射液（rpoIFN-γ）4万、40万、400万单位/头,注射液体积均为4 ml,研究rpoIFN-γ对猪外周血T细胞亚群及血清IL-2、IFN-γ含量的影响。结果发现：2组在试验第7天CD3^＋亚群比例、第7天和第14天CD4^＋亚群比例及CD4^＋/CD8^＋比值、第1天和第3天血清IL-2水平显著高于对照组（P〈0.05）;3组在试验第14天CD3^＋和CD4^＋亚群比例、CD4^＋/CD8^＋比值、血清IFN-γ含量,第7天、28天CD8^＋亚群比例,第14天、21天、28天血清IL-2含量显著高于对照组（P〈0.05）;4组CD8^＋亚群比例在第28天显著高于对照组（P〈0.05）。表明注射rpoIFN-γ对仔猪的细胞免疫有促进作用,肌注的适宜剂量是40万单位/头。

重组猪α干扰素抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞增殖的初步研究

采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)/Marc-145细胞体系验证重组猪α干扰素(rPoIFN-α)制剂的抑制病毒作用。结果表明:rPoIFN-α稀释至10^(10)可有效预防PRRSV感染Marc-145细胞;当rPoIFN-α稀释至10~8可有效抑制病毒在Marc-145细胞上的增殖。研究结果在细胞水平上明确了rPoIFN-α对PRRSV的抑制作用,为进一步将rPoIFN-α应用于动物试验提供了参考。

重组猪干扰素-γ的体外抗弓形虫作用

在体外以不同剂量的重组猪IFN-γ刺激PK15细胞和猪腹腔巨噬细胞,观察了其对弓形虫入侵细胞和在细胞内增殖的影响。结果表明,随着重组猪IFN-γ剂量的增大,巨噬细胞的抗弓形虫作用逐渐增强,而不同浓度的重组猪IFN-γ对弓形虫入侵PK15细胞均无明显影响。推测重组猪IFN-γ可激活巨噬细胞抑制弓形虫的入侵和增殖,并与剂量有关;同时说明IFN-γ在非吞噬细胞内与在巨噬细胞内的作用不同。

重组猪α干扰素冻干保护剂的筛选

为使重组猪α干扰素(rPoIFN-α)制品更好地应用于生产实践中,采用保守的冻干工艺重点对rPoIFN-α制品的冻干保护剂进行筛选,通过外观检测、水分含量、活性检测对14种冻干保护剂进行了比较和筛选。研究结果表明,终浓度2%、4%和5%的甘露醇的保护效果较好,活性保持率分别为102.8%、95.1%、108.3%。按照活性好的这三个配方再冻干三批制品进行放置40℃加速稳定性实验。结果表明,在40℃放置三个月后,三个保护剂制品效价基本没变化,稳定性良好,有效期暂定为两年。本研究初步探索了rPoIFN-α的冻干配方,为rPoIFN-α的产业化打下了基础。

重组猪α干扰素急性毒性研究

[目的]研究小白鼠体内重组猪α干扰素急性毒性反应,为临床安全用药提供依据。[方法]依据急性毒性实验原则,将小白鼠分为2大组:腹腔注射组和肌肉注射组,每组又分高、中、低3个剂量组,同时设正常对照组。给药后14d内连续观察小鼠行为活动等指标和毒性反应程度,取血作血液学检查和生化检查,以获得重组猪α干扰素初步毒性资料,并在实验结束时处死小白鼠进行剖检。[结果]各组小鼠外部表现及行为特征均正常,体温和体重的变化也在正常范围之内,内脏病理解剖无器官病变情况,血液、生化指标与正常对照组无明显差异。[结论]该实验设定的猪α干扰素最高剂量(5.0×105IU/只)及其以下剂量,均对小白鼠无明显毒性作用,在临床上应用重组猪α干扰素是安全的。

重组猪α干扰素防治仔猪流行性腹泻病试验及临床应用

针对近年在我国再次出现的猪流行性腹泻,尤其是造成初生仔猪大批死亡的情况,本试验应用酵母表达的重组猪α-干扰素开展初生仔猪流行性腹泻病的临床防治试验。选择了3个发病猪场,以口服重组猪α-干扰素方式进行防治。结果表明,口服重组猪α-干扰素对初生仔猪流行性腹泻具有较好的防治作用,仔猪存活率可达50%~70%。同时进行腹腔或/和口服补液,仔猪存活率从53%提升到71%。同时对重组猪α-干扰素进行临床防治应用,取得了较好的效果。

两种细胞株滴定重组猪α干扰素效价的比较研究

采用水泡性口炎病毒(VSV)作为攻击病毒,以微量细胞病变抑制法对同批次不同浓度的8组重组猪α干扰素(rPoIFN-α)样品进行了效价检测,以中国药品生物制品检定所指定使用的标化重组人α干扰素为效价滴定的参比标准,对在牛肾细胞(MDBK)株和人喉癌上皮细胞(HEp-2)株所得结果进行比较,并对细胞与待测样品按"一步法"和先加细胞,待细胞长满单层再加待测样品的"两步法"所得的rPoIFN-α抗病毒效价进行比较。结果表明:MDBK细胞株与HEp-2细胞株对于rPoIFN-α抗病毒活性检测结果无显著性差异,均可用于rPoIFN-α抗病毒活性的检测,重组人α干扰素滴定系统可用于rPoIFN-α效价检测。两种加样方法所得结果基本相同,推荐使用"一步法"。

重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病的研究

为了观察重组猪α干扰素对高致病性猪蓝耳病临床治疗效果,采用毕赤酵母表达系统高效表达的重组猪α干扰素制剂,按照农业部颁布的《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》进行高致病性猪蓝耳病小量临床试验。结果表明,该制剂对高致病性猪蓝耳病的治愈率超过81%。

重组猪α-干扰素的纯化及生化性质鉴定

对巴斯德毕赤酵母高效分泌表达的猪α-干扰素(PoIFN-α)纯化工艺和纯化后重组蛋白的部分生化特性进行了研究,结果表明:猪α-干扰素(PoIFN-α)发酵液经离心、透析、过滤处理之后,依次利用亲和层析和离子交换层析使目的蛋白得到了纯化.经N端氨基酸测序,Western-blot,对酸、热、巯基乙醇的稳定性和糖基化程度等检测后发现,所表达的猪α-干扰素N端氨基酸序列(前5个)正确,对酸和热基本稳定,二硫键对目的蛋白的活性至关重要,没有发现目的蛋白的糖基化.

重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病疗效观察

为更好地探讨重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病的疗效,本文主要选择了80头发病猪作为研究对象,40头进行常规治疗,40头给予重组猪α干扰素,以此对比两种治疗疗效,结果显示重组猪α干扰素治疗高致病性猪蓝耳病临床疗效显著,能有效降低病猪病死率,保护养殖用户的切身利益。

重组猪α干扰素的亲和层析

真核系统表达的猪α干扰素(PoIFN-α)发酵液,经离心、收集上清液、透析过滤处理,通过FPLC-HisTrap HP Kit亲和层析系统分离纯化,最后以SDS-PAGE银染法检验。结果表明,在不同pH和NaCl浓度情况下,发酵液经亲和层析系统分离纯化后均可以得到较为单一的目的蛋白组分,而在pH8.2,NaCl0mmol/L的情况下得到的目的蛋白更纯,且非特异性吸附也较少。

重组猪α-干扰素喷干粉剂的制备及其效果评价

为制备一种高活性、低价格重组猪α-干扰素(PoIFN-α),采用喷雾干燥技术制备出重组猪α-干扰素(rPoIFN-α)喷干粉剂,并通过对rPoIFN-α喷干粉剂的稳定性,安全性,治疗效果等质量标准进行综合评价。结果显示,本试验制备的重组猪α-干扰素喷干粉剂质量稳定性,有效期暂定为两年;除10倍剂量rPoIFN-α喷干粉剂导致猪肝脏轻微脂肪样病变,其余各较低剂量rPoIFN-α喷干粉剂对猪无毒副作用;人工感染和临床应用试验表明rPoIFN-α喷干粉剂对猪腹泻具有显著的治疗效果,为PoIFN-α喷干粉剂的工程化生产及其在养猪业中的应用提供参考。

表达重组猪α干扰素的大肠埃希工程菌分批发酵动力学模型的建立

为探究表达重组猪α干扰素的大肠埃希工程菌的分批发酵动力学基本规律,以表达猪α干扰素的基因工程重组大肠埃希菌BL21(DE3)为实验对象,观察并研究重组大肠埃希工程菌在30 L发酵罐分批发酵过程中菌体生长、重组猪α干扰素生成和基质消耗的变化规律,根据经典的Logistic方程、Luedeking-Piret方程和类似Luedeking-Piret方程对其实验结果进行非线性回归分析。结果表明:菌体生长呈典型的S型曲线,蛋白生成和菌体生长无明显的相关性,属于非生长偶联型;重组猪ɑ干扰素的产生和大肠埃希工程菌的生长速率及菌体积累量相关,菌体生长、基质消耗和产物形成模型的拟合度R2分别为0.99030、0.91095和0.96683,能较好地描述发酵中的动力学特征;重组猪ɑ干扰素蛋白得率提高了40%,由此建立的模型将为后续的连续补料、高密度发酵和工业化放大生产奠定基础。