重组猪源罗伊氏乳酸杆菌分泌表达牛乳铁蛋白肽对新生仔猪生长性能的影响以及抗腹泻病毒感染的保护作用研究

本试验旨在研究分泌表达牛乳铁蛋白肽(LFCA)的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌对新生仔猪生长性能的影响以及对引起仔猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的保护作用。试验1:选取36头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为3组,分别为重组菌组、空载菌组和对照组,每组12头仔猪,分别口服表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA/LR-CO21、含有空载体质粒的重组猪源罗伊氏乳杆菌pPG/LR-CO21和磷酸盐缓冲液(PBS)各4 mL,连续口服3 d,口服后观测时间为14 d。期间仔猪自由采食,记录各组仔猪体重变化和腹泻情况。试验2:选取30头1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪,随机分为5组,分别口服1、3、6、9、12 mL半数组织培养感染剂量(TCID 50)为10-7.50/mL的TGEV。设置7 d时间为观察期,分析半数致死量的条件。试验3:另选取1日龄、体重约为1.5 kg的新生杜长大仔猪32头,随机分为4组,分别为重组菌组、空载菌组、对照组、TGEV感染组,每组8个重复,每个重复1头仔猪。试验组每天每头按照2×1010 CFU的剂量口服pPG-LFCA/LR-CO21、pPG/LR-CO21及等体积的PBS,连续口服饲喂1周,在8日龄按照半数致死量口服TGEV感染,感染7 d后进行样品采集。记录各组仔猪体重变化和腹泻情况;苏木精-伊红(HE)染色检测小肠绒毛高度及隐窝深度;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测仔猪血清中总免疫球蛋白G(IgG)和肠黏液总分泌型免疫球蛋白A(sIgA)抗体含量;实时荧光定量PCR检测紧密连接蛋白相关基因封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)和紧密连接蛋白-1(ZO-1)以及炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及Toll样受体2(TLR2)的mRNA相对表达量;对仔猪盲肠内容物进行菌群结构分析。结果表明:口服重组猪源罗伊氏乳酸杆菌后,与对照组相比,重组菌组新生仔猪的平均日增重极显著提高(P<0.01),而腹泻率降低且差异极显著(P<0.01);与TGEV感染组相比,重组菌组仔猪平均日增重增加且腹泻率降低,差异显著(P<0.05);空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度的比值显著增加(P<0.05);仔猪血清中总IgG和肠黏液总sIgA抗体含量显著升高(P<0.05);肠黏膜组织中紧密连接蛋白相关基因Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),血清中细胞因子TNF-α含量极显著降低(P<0.01),血清IFN-γ、IL-6、IL-8、TLR2含量极显著升高(P<0.01),仔猪存活率提高。对仔猪盲肠内容物进行菌群多样性分析结果显示,TGEV感染仔猪后肠道正常菌群占比下降,相比于TGEV感染组,口服重组菌的仔猪肠道菌群致病菌拟杆菌属占比下降,差异显著(P<0.05),菌群多样性更接近对照组,肠道菌群的代谢、遗传信息处理等功能均有所增强。综上所述,本试验成功构建了分泌表达LFCA的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌菌株,经口服途径饲喂新生仔猪后,能够促进仔猪生长,降低新生仔猪的腹泻率,经口服途径饲喂感染TGEV的新生仔猪后,可以改善肠道环境,降低病毒对仔猪肠道的损伤,对仔猪抗TGEV感染提供有效保护。

猪源罗伊氏乳酸杆菌对断奶仔猪生长性能和血清指标的影响

本研究旨在探讨在饲粮中添加猪源罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)对断奶仔猪生长性能和血清指标的影响。选用平均体重为(16.57±0.23)kg的断奶仔猪(杜洛克×长白×大白三元杂交)64头,随机分成4组,每组4个重复,每个重复4头。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲粮分别在基础饲粮中添加0.25%、0.50%、0.75%的猪源罗伊氏乳酸杆菌,试验期为30 d。结果表明:1)添加0.50%和0.75%猪源罗伊氏乳酸杆菌组断奶仔猪平均日增重分别比对照组提高了7.56%(P<0.05)和20.07%(P<0.05),料重比分别比对照组降低了1.96%(P>0.05)和14.90%(P<0.05);2)饲粮中添加猪源罗伊氏乳酸杆菌能够极显著降低断奶仔猪血清中白蛋白与球蛋白比值(P<0.01),并极显著增加血清中干扰素γ含量(P<0.01);3)添加0.50%和0.75%猪源罗伊氏乳酸杆菌组断奶仔猪血清中结合珠蛋白含量分别比对照组降低了8.79%(P<0.05)和9.34%(P<0.05)。结果提示,饲粮中添加猪源罗伊氏乳酸杆菌能够提高断奶仔猪机体免疫能力,而当其达到一定添加剂量时,对于提高断奶仔猪生长性能的效果表现明显。

表达乳铁蛋白肽的猪源罗伊氏乳酸杆菌对断乳仔猪抗霍乱沙门菌感染的效果分析

旨在分析表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21作为饲用微生态制剂对仔猪促生长与抵抗猪霍乱沙门菌感染的作用。将该重组菌连续饲喂28日龄断乳仔猪21 d,并设立空菌组、对照组以及抗生素组。第21天时对断乳仔猪连续口服感染猪霍乱沙门菌3 d,并设置7 d的观察期;仔猪感染后采集试验组与对照组血清、肠黏液及肠组织。检测结果显示重组菌组仔猪平均日增重与免疫器官指数均显著提高(P<0.05),料重比极显著降低(P<0.01)。感染猪霍乱沙门菌后,相对于对照组,重组菌组仔猪日增重提高,腹泻率降低;重组菌组仔猪血液中IgG以及肠黏液中IL-4、sIgA的量极显著提高(P<0.01),IL-2、IL^(-1)2、IL-6的量显著降低(P<0.05);重组菌组仔猪肠道紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的基因转录水平和TLR4、Myd88和MLCK的基因转录水平极显著提高(P<0.01),仔猪肠道内猪霍乱沙门菌的数量极显著降低(P<0.01);重组菌组与抗生素组无明显差异(P>0.05)。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组猪源罗伊氏乳酸杆菌pPG-LFCA-E/LR-CO21可以提高断乳仔猪的生长性能、促进肠道形态发育、增强肠道屏障功能,并且在一定程度上可以保护仔猪免受猪霍乱沙门菌的感染,表明重组菌作为微生态制剂替代断乳仔猪的饲用抗生素具有一定的应用前景。

表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌在小鼠诱导的免疫应答分析

旨在构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri,L.reuteri),并评价其在小鼠体内诱导的免疫应答效果。利用PCR扩增实验室分离保存的PCV2b型毒株的cap蛋白基因,以猪源L.reuteri为宿主菌,构建表达cap蛋白的重组菌株pPG-T7 g10-PPT-cap/L.reuteri,通过口服免疫BALB/c小鼠。采用间接ELISA方法测定免疫后小鼠血清中抗原特异性IgG抗体水平,粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中抗原特异性sIgA抗体水平,小鼠血清中各细胞因子水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;流式细胞技术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4^+T细胞、CD8^+T细胞的水平;荧光定量PCR检测免疫后攻毒的小鼠体内器官的病毒载量。结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P<0.01);小鼠粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中sIgA抗体水平显著高于对照组(P<0.01);小鼠血清中细胞因子水平和对照组相比,IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高,IL-10水平降低,IFN-α无显著变化;体外孵育PCV2和小鼠脾淋巴细胞结果表明,重组乳酸菌组小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于对照组(P<0.01);流式细胞技术检测结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠脾细胞中CD4^+T细胞、CD8^+T细胞含量高于对照组;荧光定量PCR结果显示,相比于对照组,口服免疫重组乳酸菌组小鼠体内的病毒载量明显低于对照组。综上所述,本研究成功构建了表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌,经口服途径免疫动物,构建的重组乳酸杆菌能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,且具有一定的免疫保护效果。

罗伊氏乳酸杆菌LR1对猪蛋白消化酶基因表达、肌肉抗氧化指标及氨基酸组成的影响

试验旨在研究长期饲喂罗伊氏乳酸杆菌LR1(Lactobacillus reuteri 1)对猪胃及胰腺蛋白消化相关酶的基因表达、肌肉抗氧化指标及冰鲜肉氨基酸谱的影响。选用144头(杜×长×大)21日龄断奶仔猪(平均体重6.49 kg±0.04 kg),随机分为3组。对照组饲粮为基础饲粮,抗生素组饲粮为添加抗生素的基础饲粮(仔猪阶段添加100 mg/kg喹乙醇和75 mg/kg金霉素,生长肥育猪阶段添加75 mg/kg金霉素),LR1组饲粮为添加5×1010 CFU/kg LR1的基础饲粮,试验期175 d。结果表明:与对照组相比,①抗生素组猪胰腺中弹性蛋白酶的表达降低(P<0.05);LR1组胃窦、胃贲门及胃底黏膜中胃蛋白酶A的表达提高(P<0.05),同时也高于抗生素组(P<0.05)。②抗生素组猪背最长肌(longissimus dorsis muscle,LDM)总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)及总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力增加(P<0.05);LR1不影响LDM中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,T-AOC、T-SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力(P>0.05)。③饲粮添加抗生素及LR1不影响冰鲜肉水解氨基酸含量及组成(P>0.05);抗生素组24 h冰鲜肉中甲硫氨酸(苦味氨基酸)含量、甜味氨基酸总量及游离氨基酸总量降低(P<0.05),而LR1降低24 h冰鲜肉中甲硫氨酸含量(P<0.05);饲粮中添加抗生素及LR1均降低48 h冰鲜肉中甜味氨基酸、苦味氨基酸、必需氨基酸及总游离氨基酸(P<0.05),同时,抗生素组48 h冰鲜肉中鲜味氨基酸含量降低(P<0.05)。综上,与对照组相比,长期饲喂LR1可提高猪胃对蛋白质的消化功能,改善24 h冰鲜肉的风味;而长期饲喂抗生素降低猪胰腺的消化功能,提高肌肉抗氧化能力,但降低24及48 h冰鲜肉的风味。

枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌混合饲喂对仔猪肠绒毛发育的影响

本研究主要探讨混合饲喂枯草芽孢杆菌RJGP16和猪源乳酸杆菌B1对仔猪肠道肠绒毛发育的影响,以及这两种益生菌在体内拮抗大肠埃希氏菌K88的能力。试验选取8窝新生仔猪为研究对象,分别于0、7、11和26日龄经口腔灌服枯草芽孢杆菌菌液(活菌数1.0×109 CFU·mL-1)、猪源乳酸杆菌菌液(活菌数1.0×109 CFU·mL-1)、枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌混合菌液(体积比1∶1),以及对饲喂混合菌液的试验组进行大肠埃希菌K88的攻毒试验。试验结果表明,同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌能显著提高十二指肠(P<0.05)和回肠(P<0.01)的肠绒毛高度,增加十二指肠(P<0.05)和空肠(P<0.01)绒毛的数量,降低空肠(P<0.05)和回肠(P<0.01)的隐窝深度,以及增加十二指肠(P<0.05)、空肠(P<0.05)和回肠(P<0.01)的绒腺比。此外,同时饲喂这两种益生菌能有效地拮抗大肠埃希菌K88对仔猪肠道上皮的损伤。笔者的研究提示枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌对肠道绒毛的发育起到了促进作用,并能有效地提高抗感染能力。

长期饲喂罗伊氏乳酸杆菌对猪皮下脂肪及肝脏脂肪代谢相关基因表达的影响

本试验旨在研究长期饲喂罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri 1,LR1)对猪皮下脂肪及肝脏脂肪代谢相关基因表达的影响。试验选用144头21日龄三元(杜×长×大)杂交断奶仔猪,随机分为3组,每组8个重复,每个重复6头猪。对照1组饲粮基础饲粮,对照2组饲喂在基础饲粮中添加抗生素的试验饲粮,LR1组饲喂在基础饲粮中添加5×10^(10) CFU/kg LR1的试验饲粮,试验期175 d。结果表明:1)与对照1组相比,对照2组的腹脂胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)及甘油三酯脂酶(ATGL)基因相对表达量显著增加(P<0.05),肉毒碱棕榈酰转移酶-1β(CPT-1β)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、脂肪酸转运蛋白-1(FATP-1)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因相对表达量无显著差异(P>0.05);LR1组腹脂FATP-1基因相对表达量显著增加(P<0.05),SREBP、ACC、CPT-1β、FAS、PPARα、SCD、PPARγ及ATGL基因相对表达量无显著差异(P>0.05);与对照2组相比,LR1组SREBP、ACC及SCD基因相对表达量显著降低(P<0.05)。2)与对照1组相比,对照2组背脂SCD及ATGL基因相对表达量显著增加(P<0.05),而LR1组背脂SCD基因相对表达量显著降低(P<0.05);与对照2组相比,LR1组背脂ACC、FAS及SCD基因相对表达量显著降低(P<0.05);与对照1、2组相比,LR1组背脂PPARγ基因相对表达量显著提高(P<0.05)。3)与对照1组相比,对照2组及LR1组肝脏SREBP、ACC、FAS及SCD基因相对表达量均显著降低(P<0.05),而CPT-1β、PPARα、FATP-1、PPARγ及ATGL基因相对表达无显著变化(P>0.05)。综上所述,LR1促进猪皮下脂肪的脂肪酸转运,较抗生素显著降低了猪背脂及肝脏脂肪合成代谢。此外,LR1不影响肝脏的转运及分解代谢。

猪用复合微生态制剂制备及保存期内活菌数研究

为了确定两种猪肠道益生菌的固体发酵效果,以及复合微生态制剂在不同保存条件下的活菌数变化。对猪肠道益生菌干酪乳杆菌、罗伊氏乳酸杆菌进行固体发酵,测定其活菌数,然后按照一定比例将两种益生菌与液体发酵的纳豆芽孢杆菌冻干菌粉混合制成复合微生态制剂;测定该制剂在4℃和室温保存状态下14 d内及半年内益生菌活菌数量的变化。保存14 d内的微生态制剂,室温条件下活菌数先增加后逐渐减少,而4℃保存的制剂活菌数缓慢减少。室温保存状态下的微生态制剂活菌数半年内迅速减少,4℃保存的微生态制剂益生菌死亡的速度比室温保存的略微缓慢,但差异不显著(p>0.05)。半年后对4℃和室温保存状态下保存的益生菌活菌数计数结果分别为1.3×109CFU.g-11、.5×109CFU.g-1,微生态制剂活菌数仍能超过3×108CFU.g-1,可以继续使用。研究表明复合微生态制剂中的乳酸菌在4℃和室温条件下均能保存活性半年以上。