恶性疟原虫保护性抗原复合基因-痘苗病毒重组活疫苗株的构建

将本实验室合成的一段编码恶性疟原虫不同发育阶段抗原表位基因，包括裂殖子表面抗原ＭＳＡ１、ＭＳＡ２、环子孢子蛋白ＣＳＰ及环状体感染红细胞表面蛋白ＲＥＳＡ以及来自白细胞介素－１（ＩＬ－１）和破伤风类毒素（ＴＴ）上Ｔ细胞激活位点等的复合抗原基因（ＨＧＦＳＰ），先定向克隆人ｐＳＫ载体的ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点，后用ＥｃｏＲＩ单酶切、补平及用ＳａｃⅠ单酶切下的目的基因再定向克隆人痘苗病毒表达载体ＰＪ２－１６的ＳｍａⅠ、ＳａｃⅠ位点，转化ＴＧ－Ⅰ宿主菌，重组子经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶分析及酶谱等鉴定，证实并筛选出了目的基因已插入到ＰＪ２－１６血凝素（ＨＡ）基因内的重组子，构建了恶性疟原虫抗原基因－痘苗病毒表达载体。将该重组表达载体与痘苗病毒天坛株经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ处理，在Ｃｏｓ－７细胞内进行共转染和同源重组，转染物接种ＢＨＫ２１细胞，经鸡红细胞吸附试验挑选不吸附鸡红细胞的病毒斑（ＨＡ－），共筛选出两株ＨＡ－重组病毒，用抗该目的基因大肠杆菌表达蛋白抗体对重组病毒表达产物进行间接免疫荧光、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等试验证明，两株重组病毒中有一株可表达目的蛋白，蛋白分子量与按目的基因长度?

非复制重组痘苗病毒天坛株C-K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究

将反向串联的痘苗病毒启动子 p11k和 p7.5k表达结构引入非复制痘苗病毒质粒载体 ,得到非复制痘苗病毒表达载体 pNEOCK11β75、pNEOCK75 11β、pNEOCK1175和 pNEOCK75 11。利用载体 pNEOCK11β75、pNEOCK75 11β及 pNEOCK11β75IL6和RVJ12 3重组病毒进行同源重组 ,分别得到非复制重组痘苗病毒RVJ12 3Δ11β75、RVJ12 3Δ75 11β及RVJ12 3Δ11β75IL6。Southern blot证实 :重组病毒RVJ12 3Δ11β75C K片段间大片段基因的稳定缺失 ,同时 β 半乳糖苷酶基因插入到缺失区内并稳定表达 ,不影响另外非必需区外源基因的表达 ,缺失区内两外源基因的表达无相互干扰 。

SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并获得SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD并通过各项试验证明其安全性和免疫原性。

表达乙型肝炎病毒表面抗原的非复制型重组痘苗病毒疫苗株RVJ123ΔCK的构建及其生物学性状鉴定

利用重组质粒 pNeo-CK与 pNeo-CKLacZ和表达乙型肝炎 (乙肝 )病毒S抗原的重组痘苗病毒RVJ12 3[1] ,构建了非复制型重组痘苗病毒RVJ12 3ΔCK。Southernblot证实 ,非复制型重组病毒RVJ12 3ΔCK基因组C和K片段间与宿主范围和毒力相关的基因稳定缺失 ,同时 ,J片段中插入的乙肝S抗原基因稳定存在。重组病毒RVJ12 3ΔCK在鸡胚成纤维母细胞中可良好繁殖 ,而在人源细胞系中不繁殖或仅低度繁殖 ,但都能表达HBsAg ,并且在病毒一个复制周期内 ,复制型和非复制型病毒HBsAg表达水平无明显差别。

利用中国流行株HIV-1 Gag重组痘苗病毒与核酸疫苗免疫的新程序

目的 将中国流行株ＨＩＶ－１ Ｇａｇ基因在痘苗病毒中表达，以重组痘苗病毒与核酸疫苗混合免疫，进 而研制艾滋病疫苗。方法 将中国流行株ＨＩＶ－１ Ｇａｇ基因片段插入到ｐＪ３８载体启动子下游，经同源重组和血凝素 阴性空斑筛选重组痘苗病毒，经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ检测目的蛋白。以重组痘苗病毒与核酸疫苗进行小鼠免 疫试验，淋巴细胞转化实验，ＣＩＬ，ＣＤ＋４；ＣＤ＋８细胞计数及细胞免疫和体液免疫水平检测。结果 重组痘苗病毒ｖＪ３８ Ｇａｇ具有良好的免疫原性，与２ｒＶＶ－ＤＮＡ混合免疫效果更好。结论 重组痘苗病毒 ｖＪ３８ Ｇａｇ能够表达Ｇａｇ蛋白并诱 导机体产生细胞免疫和体液免疫。

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法 ,对HPV5 81L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰 ,并保留氨基酸不变。选用非复制型重组痘苗病毒为载体 ,将修饰的L1基因 1 5kb和L2基因 1 4kb分别插入痘苗病毒表达载体 pJSD的 7 5k和H6早期启动子之后 ,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组。经单斑筛选纯化 ,获得共表达HPV5 8L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株。该病毒在CEF细胞上连续传至第15代 ,经斑点杂交分析 ,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入 ;经Westernblot检测 ,重组病毒能稳定表达HPV5 81L1及L2蛋白。此结果为HPV5

HIV-1中国流行株gag与hIL-2在重组痘苗病毒中的共表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

目的：将HIV-1中国流行株B亚型gag基因、gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达，以期获得重组痘苗病毒，观察细胞因子的佐剂作用，与核酸疫苗混合免疫，评价免疫效果，为新型艾滋病疫苗研制开发打下基础。方法：将HIV-1中国流行株 gag基因、gag和hIL-2基因片段插入到 pJ38载体启动子下游，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒，SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫Balb/c小鼠，进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4+、CD8+ T细胞数目以及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果：获得了重组痘苗病毒 vJ38gag和 vJ38gag-IL-2。与 vJ38-gag相比，vJ38gag-IL-2，具有更好的免疫原性，重组痘苗病毒免疫3次的效果好于重组病毒免疫2次，以2rVV-DNA混合免疫效果最好。结论：重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。细胞因子IL-2发挥了免疫佐剂的作用。

表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗,首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pVI75转移质粒,并将HIV-Ⅰ中国主要流行株B’/C重组株CN54 gagpol基因置于pVI75的启动子pE/L下,构建重组质粒pVI75-Gagpol。重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞。前三轮通过G418加压,噬斑纯化,得到既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒;后三轮在无G418选择压力下,筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的白色重组痘苗病毒。结果表明筛选到了一株重组病毒,经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因已丢失;PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中;抗体染色和Western blot结果证实该重组病毒能很好地表达目的蛋白。

用免疫蚀斑方法筛选重组痘苗病毒疫苗株

用间接免疫酶方法在硝酸纤维膜上检查、筛选和回收重组痘苗病毒。作为人用疫苗株的筛选，此法较核酸杂交方法更简便、直观和准确，在筛选重组病毒的同时确定了病毒在感染细胞上的表达。构建了含痘苗病毒７．５ｋ启动子和ＥＢ病毒膜抗原基因的转移载体，从转染细胞的病毒混合液中用特异性ＭｃＡｂ和间接免疫酶方法直接筛选表达ＥＢ病毒膜抗原的重组痘苗病毒，并从阳性酶斑中回收具感染性病毒。

表达HIV-1多价合成基因的重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制适合我国使用的HIV疫苗,选择具有代表意义的中国流行株HIV CN54(B′/C)病毒gag、pol、nef等基因的合成基因syngpnef,插入到自行构建的能在病毒筛选过程中将标记基因去除掉的双标记基因痘苗病毒载体pVI75的KpnI酶切位点,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,与我国的天坛株痘苗病毒共转染鸡胚成纤维细胞,通过蓝白斑筛选得到的重组病毒疫苗株DNA。经PCR鉴定标记基因已被删除并有目的基因的整合,Western blot可检测到目的基因的融合表达。此重组病毒疫苗株有望成为HIV/AIDS候选疫苗。

HIV-1中国流行株gag-hIL-2重组痘苗病毒与pIRES-gag-hIL-2核酸疫苗联合免疫的实验研究

目的 将HIV 1中国流行株B亚型gag和hIL 2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达 ,与核酸疫苗联合免疫 ,评价免疫效果 ,为新型艾滋病疫苗开发研制奠定基础。方法 将HIV 1中国流行株gag hIL 2基因片段插入到痘苗病毒载体pJ38启动子下游 ,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒 ,SDS PAGE、Westernblot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫BALB c小鼠 ,进行淋巴细胞转化实验及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果 获得了重组痘苗病毒vJ38gag IL 2 ,具有更好的免疫原性 ,3rVV效果好于 2rVV ,以 2rVV DNA混合免疫效果最好。结论 重组痘苗病毒vJ38gag IL

痘苗病毒天坛株非必需区TA25R…TA36L的两步重组表达载体的构建

针对痘苗病毒天坛株非必需区ＴＡ２５Ｒ－ＴＡ３６Ｌ，构建了可去除ＴＡ２６Ｒ至ＴＡ３５Ｌ的１０个ＯＲＦｓ，并同时表达ＬａｃＺ基因的两步重组表达载体ｐＡ２４２７ＬａｃＺ。通过两种方法（一步重组和两步重组）获得了在该区域表达ＬａｃＺ基因的重组痘苗病毒ＲＶＡ２４２７ＬａｃＺ。实验表明，一步重组法获得重组病毒的机率大约为１‰，两步重组法的机率可达６２．５‰。由此可见，两步重组法可显著提高重组病毒的筛选机率。ＬａｃＺ基因可以在该区域中稳定表达，重组病毒与野毒株在繁殖能力上没有明显差别，表明ＴＡ２５Ｒ－ＴＡ３６Ｌ是较稳定的外源基因插入区域。上述结果对于深入研究该非必需区的功能特点。

痘苗病毒天坛株基因组旁侧区结构及开放读码框架的分析

本文分析了我国痘苗病毒天坛株基因组两端的ＨｉｎｄⅢ－Ｃ和－Ｂ片段所编码的多肽，并与其他痘苗病毒株和正痘病毒进行了比较。结果表明，天坛株基因组ＨｉｎｄＩＩ－Ｃ和－Ｂ片段共有４６个主要的开放读码框架（ＰＲＦｓ），其中一个ＯＲＦ属于痘苗病毒基因组中第一次发现的与天花病毒相似的基因编码区。此外，天坛株基因组丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅱ的编码区由于移码变异而分成两个不同ＯＲＦｓ。与其他痘苗病毒株相比，天坛株基因组有多个ＯＲＦｓ的缺失，以上现象提示，天坛株在生物学性状上与其他毒株的差异可能与此有关。

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

【目的】重组新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21d分别以vvIBDVGx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV-VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120h,脑内致病指数(ICPI)分别为0.4和0.36,静脉内致病指数(IVPI)均为0;接种后72～96h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100%保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90%以上。【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病-新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。

适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体的构建

为构建适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体,利用标记瞬时稳定的原理,在痘苗病毒单选择标记载体psc65的基础上,构建成带有neo和LacZ双选择标记的痘苗病毒载体pVI75。为检验载体pVI75的有效性,将HIV-1合成基因syngpnef插入到载体pVI75上,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,并与天坛株752-1痘苗病毒共转染CEF细胞。筛选得到的重组病毒经PCR和Dotblot检验表明,标记基因已被删除,而目的基因被整合到痘苗病毒基因组上。Westemblot检测结果表明,目的基因的表达正确。痘苗病毒载体pVI75的构建使得疫苗株筛选的工作量大为降低,时间大大缩短,为利用痘苗病毒载体构建重组病毒疫苗株的研究提供了参考。

重组鸡痘病毒vFV282疫苗株理化特性测定

将重组鸡痘病毒疫苗株vFV282经酸、碱、热、氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,接种到CEF上,观察处理前后重组鸡痘病毒疫苗株vFV282毒力活性的变化,分析这些理化因子对重组鸡痘病毒疫苗株vFV282的影响.结果在pH 3.0～pH 9.0范围内,pH变化不会造成该重组鸡痘病毒疫苗株vFV282毒力活性的显著变化.该重组鸡痘病毒疫苗株vFV282经50 ℃ 60 min、55 ℃ 30 min或60 ℃ 15 min即可被灭活,对氯仿敏感,经胰蛋白酶37 ℃作用1 h,TCID50降低2.55 logTCID50/0.1 mL,对乙醚不敏感,经乙醚作用24 h, TCID50下降1.0 log TCID50/0.1 mL.

应用重组痘苗病毒发展活疫苗的前景

痘苗病毒曾被用于消灭天花。近年来,由丁分子病毒学和基因工程技术的进展,痘苗病毒作为表达外源基因的载体,又重新受到科学界的注意。在实际工作中,重组痘苗病毒可被用作体外或体内表达载体:前者系在细胞培养中表达所需产物,经提纯后用于医学目的。与其他表达系统相比。

重组鸡痘病毒vFV282疫苗株免疫鸽抗体消长规律的检测

目的:检测重组鸡痘病毒vFV282疫苗株免疫鸽后的抗体消长规律。方法:将共表达NDV F、IBDV VPO基因重组鸡痘病毒免疫30日龄的幼鸽,将鸽子分为2组,分为刺种组和对照组,每组40只,按一个使用剂量(每0．1 ml含毒≥105.5 TCID50)进行免疫,对照组刺种生理盐水,在免疫后的第7、14、21、28、35、42、49和56天采血,并分离血清,将血清5℃、30分钟灭活,用固定病毒稀释血清血清中抗FPV、NDV、IBDV的抗体效价,统计结果,并用SPSS 10．0分析。结果:鸽刺种后,抗FPV 中和抗体效价免疫后7天显著升高,14天达到高峰,且保持到21天以后,28天开始下降,49天时仍保持一定水平;抗NDV和抗体效价免疫后7天显著升高,14天达到高峰,且保持到21天以后,28天开始下降。56天时仍保持一定水平;抗IBDV中和抗体效价免疫后7天显著升高,14天达到高峰,且保持到21天以后,28天后开始下降,49天时仍保持一定水平。结论:重组鸡痘病毒vFV282疫苗株免疫鸽后,鸽产生了良好的免疫力。

基于改良型痘苗病毒安卡拉株载体的新型流感疫苗研究进展

流感是由流感病毒引起的一种严重危害公众健康的呼吸道传染病,已引起全球的高度关注,接种疫苗是预防流感最有效的措施。当前,建立快速流感疫苗研发生产平台对于流感的预防与控制至关重要。以病毒为载体的活疫苗为感染性疾病的防控提供了新的手段。改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia virus Ankara,MVA)是一种复制缺陷型病毒载体。MVA能够同时容纳并表达多个外源抗原、诱导较好的体液和细胞免疫应答并具备良好的安全性,具有成为理想疫苗载体的潜力。本文就MVA载体在流感疫苗研究中的应用做一综述。

HIV-1复制型DNA疫苗与非复制型重组痘苗病毒疫苗在小鼠体内细胞免疫效果的研究

目的:用HIV-1复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗(rNTV-C)进行单独免疫和联合免疫的研究(2种疫苗分别包含HIV-1 B'/C亚型的gp160、gag-pol、rev-tat-nef等6种基因),以了解这2种新型HIV疫苗单独免疫及联合免疫的效果,并为临床免疫方案的制定提供实验依据。方法:将HIV-1 DNA疫苗和rNTV-C疫苗免疫BALB/c小鼠,设计rNTV-C单独免疫组、DNA单独免疫组,以及DNA初免、rNTV-C加强的联合免疫组,并设计不同免疫途径和不同剂量的各种组合。用IFN-γELISPOT检测各组的细胞免疫效果,用统计学方法分析比较各组细胞免疫效果的差异。结果:DNA疫苗和rNTV-C疫苗单独免疫时,二者都能诱发针对各抗原的特异性免疫反应;联合免疫能够诱发比DNA或rNTV-C单独免疫都强的特异性细胞免疫反应。统计分析显示,2种疫苗采用肌肉注射途径的免疫效果显著高于皮内注射,1μg和5μg DNA疫苗的免疫效果差异不显著,而1×108 PFU的rNTV-C比2×107PFU的免疫效果要强。结论:联合免疫策略能够显著增强HIV-1疫苗各抗原的免疫原性,通过对2种HIV-1疫苗单独免疫及二者联合免疫的细胞免疫反应的分析比较,确定了较好的免疫方案,为疫苗临床前免疫效果评价和临床方案的制定提供了实验依据。