SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并获得SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD并通过各项试验证明其安全性和免疫原性。

非复制重组痘苗病毒天坛株C-K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究

将反向串联的痘苗病毒启动子 p11k和 p7.5k表达结构引入非复制痘苗病毒质粒载体 ,得到非复制痘苗病毒表达载体 pNEOCK11β75、pNEOCK75 11β、pNEOCK1175和 pNEOCK75 11。利用载体 pNEOCK11β75、pNEOCK75 11β及 pNEOCK11β75IL6和RVJ12 3重组病毒进行同源重组 ,分别得到非复制重组痘苗病毒RVJ12 3Δ11β75、RVJ12 3Δ75 11β及RVJ12 3Δ11β75IL6。Southern blot证实 :重组病毒RVJ12 3Δ11β75C K片段间大片段基因的稳定缺失 ,同时 β 半乳糖苷酶基因插入到缺失区内并稳定表达 ,不影响另外非必需区外源基因的表达 ,缺失区内两外源基因的表达无相互干扰 。

痘苗病毒天坛株非必需区TA25R…TA36L的两步重组表达载体的构建

针对痘苗病毒天坛株非必需区ＴＡ２５Ｒ－ＴＡ３６Ｌ，构建了可去除ＴＡ２６Ｒ至ＴＡ３５Ｌ的１０个ＯＲＦｓ，并同时表达ＬａｃＺ基因的两步重组表达载体ｐＡ２４２７ＬａｃＺ。通过两种方法（一步重组和两步重组）获得了在该区域表达ＬａｃＺ基因的重组痘苗病毒ＲＶＡ２４２７ＬａｃＺ。实验表明，一步重组法获得重组病毒的机率大约为１‰，两步重组法的机率可达６２．５‰。由此可见，两步重组法可显著提高重组病毒的筛选机率。ＬａｃＺ基因可以在该区域中稳定表达，重组病毒与野毒株在繁殖能力上没有明显差别，表明ＴＡ２５Ｒ－ＴＡ３６Ｌ是较稳定的外源基因插入区域。上述结果对于深入研究该非必需区的功能特点。

恶性疟原虫保护性抗原复合基因-痘苗病毒重组活疫苗株的构建

将本实验室合成的一段编码恶性疟原虫不同发育阶段抗原表位基因，包括裂殖子表面抗原ＭＳＡ１、ＭＳＡ２、环子孢子蛋白ＣＳＰ及环状体感染红细胞表面蛋白ＲＥＳＡ以及来自白细胞介素－１（ＩＬ－１）和破伤风类毒素（ＴＴ）上Ｔ细胞激活位点等的复合抗原基因（ＨＧＦＳＰ），先定向克隆人ｐＳＫ载体的ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点，后用ＥｃｏＲＩ单酶切、补平及用ＳａｃⅠ单酶切下的目的基因再定向克隆人痘苗病毒表达载体ＰＪ２－１６的ＳｍａⅠ、ＳａｃⅠ位点，转化ＴＧ－Ⅰ宿主菌，重组子经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶分析及酶谱等鉴定，证实并筛选出了目的基因已插入到ＰＪ２－１６血凝素（ＨＡ）基因内的重组子，构建了恶性疟原虫抗原基因－痘苗病毒表达载体。将该重组表达载体与痘苗病毒天坛株经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ处理，在Ｃｏｓ－７细胞内进行共转染和同源重组，转染物接种ＢＨＫ２１细胞，经鸡红细胞吸附试验挑选不吸附鸡红细胞的病毒斑（ＨＡ－），共筛选出两株ＨＡ－重组病毒，用抗该目的基因大肠杆菌表达蛋白抗体对重组病毒表达产物进行间接免疫荧光、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等试验证明，两株重组病毒中有一株可表达目的蛋白，蛋白分子量与按目的基因长度?

适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体的构建

为构建适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体,利用标记瞬时稳定的原理,在痘苗病毒单选择标记载体psc65的基础上,构建成带有neo和LacZ双选择标记的痘苗病毒载体pVI75。为检验载体pVI75的有效性,将HIV-1合成基因syngpnef插入到载体pVI75上,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,并与天坛株752-1痘苗病毒共转染CEF细胞。筛选得到的重组病毒经PCR和Dotblot检验表明,标记基因已被删除,而目的基因被整合到痘苗病毒基因组上。Westemblot检测结果表明,目的基因的表达正确。痘苗病毒载体pVI75的构建使得疫苗株筛选的工作量大为降低,时间大大缩短,为利用痘苗病毒载体构建重组病毒疫苗株的研究提供了参考。

表达乙型肝炎病毒表面抗原的非复制型重组痘苗病毒疫苗株RVJ123ΔCK的构建及其生物学性状鉴定

利用重组质粒 pNeo-CK与 pNeo-CKLacZ和表达乙型肝炎 (乙肝 )病毒S抗原的重组痘苗病毒RVJ12 3[1] ,构建了非复制型重组痘苗病毒RVJ12 3ΔCK。Southernblot证实 ,非复制型重组病毒RVJ12 3ΔCK基因组C和K片段间与宿主范围和毒力相关的基因稳定缺失 ,同时 ,J片段中插入的乙肝S抗原基因稳定存在。重组病毒RVJ12 3ΔCK在鸡胚成纤维母细胞中可良好繁殖 ,而在人源细胞系中不繁殖或仅低度繁殖 ,但都能表达HBsAg ,并且在病毒一个复制周期内 ,复制型和非复制型病毒HBsAg表达水平无明显差别。

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法 ,对HPV5 81L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰 ,并保留氨基酸不变。选用非复制型重组痘苗病毒为载体 ,将修饰的L1基因 1 5kb和L2基因 1 4kb分别插入痘苗病毒表达载体 pJSD的 7 5k和H6早期启动子之后 ,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组。经单斑筛选纯化 ,获得共表达HPV5 8L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株。该病毒在CEF细胞上连续传至第15代 ,经斑点杂交分析 ,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入 ;经Westernblot检测 ,重组病毒能稳定表达HPV5 81L1及L2蛋白。此结果为HPV5

基于改良型痘苗病毒安卡拉株载体的新型流感疫苗研究进展

流感是由流感病毒引起的一种严重危害公众健康的呼吸道传染病,已引起全球的高度关注,接种疫苗是预防流感最有效的措施。当前,建立快速流感疫苗研发生产平台对于流感的预防与控制至关重要。以病毒为载体的活疫苗为感染性疾病的防控提供了新的手段。改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia virus Ankara,MVA)是一种复制缺陷型病毒载体。MVA能够同时容纳并表达多个外源抗原、诱导较好的体液和细胞免疫应答并具备良好的安全性,具有成为理想疫苗载体的潜力。本文就MVA载体在流感疫苗研究中的应用做一综述。

痘苗病毒天坛株载体研究与应用概述

1982年,文献首次报道外源基因成功在痘苗病毒WR株(小鼠嗜神经毒株)中获得表达,引起了中国科学家的极大关注。1984年,中国医学科学院病毒学研究所在朱既明院士的组织下成立了痘苗病毒基因表达载体研究协作组,提出使用痘苗病毒天坛株开发可用于人体的痘苗病毒基因表达载体的新思路。该研究历时10余年,成功构建了痘苗病毒天坛株高效表达载体,并广泛用于外源基因表达、基因工程疫苗研究、单克隆抗体研制和诊断试剂开发。本文简单介绍了该载体的研究及应用,并对载体疫苗存在的问题及发展前景进行了讨论。

表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗,首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pVI75转移质粒,并将HIV-Ⅰ中国主要流行株B’/C重组株CN54 gagpol基因置于pVI75的启动子pE/L下,构建重组质粒pVI75-Gagpol。重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞。前三轮通过G418加压,噬斑纯化,得到既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒;后三轮在无G418选择压力下,筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的白色重组痘苗病毒。结果表明筛选到了一株重组病毒,经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因已丢失;PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中;抗体染色和Western blot结果证实该重组病毒能很好地表达目的蛋白。

用免疫蚀斑方法筛选重组痘苗病毒疫苗株

用间接免疫酶方法在硝酸纤维膜上检查、筛选和回收重组痘苗病毒。作为人用疫苗株的筛选，此法较核酸杂交方法更简便、直观和准确，在筛选重组病毒的同时确定了病毒在感染细胞上的表达。构建了含痘苗病毒７．５ｋ启动子和ＥＢ病毒膜抗原基因的转移载体，从转染细胞的病毒混合液中用特异性ＭｃＡｂ和间接免疫酶方法直接筛选表达ＥＢ病毒膜抗原的重组痘苗病毒，并从阳性酶斑中回收具感染性病毒。

以痘苗病毒为载体研制重组疫苗的进展

痘苗病毒作为真核表达载体已广泛应用于外源基因的表达,并日益受到重视。本文综述痘苗病毒的生物学特性及作为表达载体的可能性,重组痘苗病毒的构建原则及外源基因的表达情况。

重组痘苗病毒载体研究进展

通过同源重组将外源基因插入到痘苗病毒基因组内,以痘苗病毒为载体使外源基因在动物细胞内表达以获得目的蛋白,从而达到免疫接种的目的。痘苗病毒有宿主范围广、允许插入外源基因片段长、可通过多种途径进行接种、能诱导体液和细胞免疫反应及易于增殖生产等优点,在疫苗研制中得到了广泛的应用。以痘苗病毒作为载体表达狂犬病病毒糖蛋白研制成的狂犬病疫苗已经在野生动物狂犬病控制中发挥了巨大的作用,用痘苗病毒研制的艾滋病病毒疫苗也已经进入了临床试验。

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗系以高度成熟安全的鸡痘病毒为载体研制的新型基因工程禽流感一鸡痘二联疫苗，该疫苗毒株的研制是采用重组DNA技术，将我国H5N1亚型禽流感病毒早期分离株的HA和NA基因同源重组到鸡痘病毒疫苗株的基因组中，构建重组鸡痘病毒(rFPV—HA—NA)，经体外、体内试验表明该重组鸡痘病毒具有良好的免疫原性。同时经细胞连续传代，证实了重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性，从而进一步保证了该疫苗的免疫原性。

犬腺病毒 1型疫苗株 E3缺失表达载体的构建

探索以犬腺病毒 1型疫苗株 (Cannaught Laboratory Limited, CLL)作为病毒重组疫苗和基因转移载体的可行性。方法构建带增强型绿色荧光蛋白（ enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因的 E3缺失重组病毒 CLLEGFP。将 CLLEGFP感染各种人源细胞，并以灌胃、腹腔注射、尾静脉注射和肌肉注射等不同途径接种昆明小鼠。多时间点取小鼠组织标本，冷冻干燥切片，观察 EGFP的表达。 4周后采集小鼠血清，以 Western blot分析抗 EGFP抗体的产生。结果 CLLEGFP能够感染各种人源细胞并表达 EGFP。在腹腔接种 CLLEGFP 3 d的小鼠肝组织细胞中可见转导的 EGFP。 Western blot分析显示，以各种途径免疫接种重组病毒 4周后的小鼠血清中均存在抗 EGFP特异抗体。结论 CLL具有开发成为病毒重组疫苗和基因转移载体的潜力。

埃博拉腺病毒-5载体重组疫苗在中国健康成人中的安全性和免疫原性

到目前为止,所有用于试验的埃博拉病毒疫苗都是基于1976年扎伊尔暴发的病毒株。这里,作者旨在评估表达2014病毒流行株糖蛋白的基于腺病毒-5的新型重组型埃博拉载体疫苗的安全性及免疫原性。这项随机、双盲、安慰剂对照的一期临床试验在中国江苏省台州县开展。年龄18~60岁的健康成人被列入试验对象并用计算机生成的随机化区组（区组大小为6）进行随机化分组（2∶1）,

猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因 ,并将其克隆到 pMD 18 T载体 ;经转化、筛选、鉴定后 ,测定了核苷酸序列 ,根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行 gp5 5氨基酸序列推导 ,并进行同源性比较。结果表明 ,该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为 81.9%、83.4 %和83.5 % ;相应地 ,gp5 5氨基酸同源性分别为 94 .8%、95 .6 %和 95 .3%。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体 pFastBacHTb后获得了重组质粒 pFBHT E2 ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,发生转座作用 ;经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA ,将其命名为rBacmid E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。

腺病毒载体构建及在疫苗研制上的应用

痘苗病毒载体研究和应用虽多,但国际卫生组织(WHO)已宣布全球消灭天花可不再种痘,加之该病毒用于生物体后可以引起机体发生免疫排斥反应,限制了目的基因在生物体内长期有效的表达,也给重复接种带来困难,而且痘苗病毒对生物体还具有一定毒性作用,人类种痘偶尔产生严重副反应,从而限制了其使用范围。目前在改造腺病毒基因组方面已取得明显进展,证明腺病毒是基因工程疫苗的重要载体,倾向于以腺病毒为表达载体发展多价重组口服活疫苗,尤其在乙型肝炎和狂犬病疫苗研制上成效卓著,安全的腺病毒载体疫苗必将产生并成功地得到临床应用。本文着重从腺病毒载体构建。

重组病毒载体疫苗的研究新进展

重组病毒载体疫苗是以病毒为载体递送目的抗原的一种疫苗。病毒载体技术路线早期多用于动物疫苗和难以用传统技术路线开发的病原体疫苗。我国针对新型冠状病毒感染疫苗研发布局的5条技术路线中, 因重组病毒载体疫苗具备可同时产生较强的体液和细胞免疫、可通过黏膜途径接种以及1剂完成免疫程序等优势而获批上市, 并在疫情防控中起到了重要作用。但重组病毒载体疫苗因预存免疫问题, 即存在可能降低疫苗保护效力、为增强免疫原性可能导致安全性风险提升等因素, 故上市的重组病毒载体疫苗产品较少。随着基因工程技术、分子生物学技术的发展, 病毒载体种类日渐增多, 并在多种疫苗中得到应用。此文就重组病毒载体疫苗的研发现状进行综述。