猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列(登录号:CP002525.1)设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用KpnⅠ和XhoⅠ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR^259中,构建PCR^259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR^259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法(IFTA)检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列(登录号:CP002525.1)同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR^259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR^259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR^259-ENO构建成功。

卡介苗穿梭表达质粒pMSIL-2的构建及鉴定

目的 构建分泌性表达白介素 (IL) 2的重组卡介苗 (BCG)。方法 分别以BCG和IL 2cDNA为模板 ,通过PCR扩增得到约 117bp的BCG抗原 85B(BCG Ag85B)信号肽序列和 399bp的IL 2基因序列。将BCG Ag85B信号肽序列克隆至大肠杆菌 BCG穿梭质粒 pMV2 6 1,得到重组质粒 pMS。再将IL 2基因克隆至 pMS中 ,得到重组质粒pMSIL 2。 结果 质粒 pMSIL 2经双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实 ,克隆基因BCG Ag85B信号肽和IL 2正确插入载体 pMV2 6 1。结论 重组质粒 pMSIL 2可望在BCG中分泌性表达细胞因子IL 2 ,该质粒的构建成功为改造BCG、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。

卡介苗穿梭质粒pMSIFN-α2a的构建与鉴定

目的构建分泌性表达IFN-α2a的卡介苗重组质粒。方法分别以卡介苗(BCG)和IFN-α2a cD-NA为模板,通过PCR扩增得到约117bp的BCG-Ag85B信号肽序列和495bp的IFN-α2a基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMS。再将IFN-α2a基因序列克隆至pMS中,得到重组质粒pMSIFN-α2a。结果质粒pMSIFN-α2a用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因BCG-Ag85B和IFN-α2a正确插入载体pMV261。结论重组质粒pMSIFN-α2a可望在BCG中分泌性表达细胞因子IFN-α2a,从而促进IFN-γ的释放,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础。

转基因逆转椎间盘退变重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1的构建

目的 构建一个高效的重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1,用于进一步的基因转移逆转椎间盘退变的实验研究。方法 应用一种新的重组腺病毒构建系统来构建腺病毒载体。首先将hTGFβ1的cD-NA亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上。重组穿梭质粒pShuttle-CMV-hTGFβ经PmeI酶切线性化后,与超螺旋的病毒质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183。两种质粒在BJ5183中进行同源重组,重组病毒质粒pAd/CMV-hTGFβ1经卡那霉素平板筛选获得。经酶切分析鉴定后,重组病毒质粒用PacI酶切线化。线化的病毒质粒经脂质体转染293细胞(包装细胞系),于2周内收集重组病毒。结果 重组腺病毒质粒经BamHI,PacI酶切鉴定,在0.8％的琼脂糖凝胶电泳中出现了诊断性片段;感染的293细胞出现了明显的细胞病变效应(CPE);PCR产物电泳证实了重组病毒的存在;免疫组织化学染色证实了hTGF-β1在293细胞中的表达。结论 重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1的获得以及目的基因表达的验证使下一步的逆转椎间盘退变的实验研究成为可能。

结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定

目的构建结核杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统中Pup、Dop、PafA和Mpa基因的重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,并对其进行鉴定。方法提取结核杆菌国际标准强毒株H37Rv基因组DNA,以此为模板PCR扩增Pup、Dop、PafA和Mpa基因编码序列并测序。扩增产物克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,利用PCR技术、双酶切技术及基因测序技术对构建的重组穿梭表达质粒进行鉴定。结果 PCR扩增的Pup、Dop、PafA和Mpa基因片段分别为213、1 683、1 377、和1 848bp,与预期长度一致;双酶切鉴定Pup、Dop、PafA和Mpa基因均成功插入穿梭表达质粒pMV361,测序显示插入穿梭表达质粒pMV361的Pup、Dop、PafA和Mpa基因序列与GenBank公布的序列一致。结论成功构建了重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,为进一步研究结核分枝杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统奠定了基础。

人低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人HIF1α腺病毒表达载体,研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用。方法采用分子克隆技术,从pcDNA3.1/V5-HisA-HIF1α质粒获得HIF1αcDNA,经pcDNA3.1(+)克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组穿梭质粒,含有HIF1αcDNA的表达盒通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-XViralDNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×109pfu/mL。结论成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α,为冠心病的基因治疗研究奠定基础。

THE CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF RECOMBINANT SHUTTLE PLASMID WITH OMPL1 GENE FROM LEPTOSPIRA INTERROGANS SEROVAR LAI STRAIN 017 IN BACILLE CALMETTE-GUERIN

Objective.To construct recombinant BCG again st leptospirosis.Methods.We amplified the entire open readin g frame of the OmpL1gene from the genome of the leptospire serovar Lai strain 017.Two recombin ant plasmids pBQ1and pBQ2were constructed by oriented ligation based on the E.coli-BCG shuttle plasmids pMV261and pMV361respectively.The recombinant plasmids were transformed into BCG by electroporation.The rBCGs bearing pBQ1and pBQ2were induced by high temperature of 45℃.Results.The expressed product,a 35kD prote in was detected by SDS-PAGE.The resu lt indicates that pBQ1and pBQ2can express OmpL1in rBCG.Conclusion.The technical methods in this study may help detect the immunogenicity a nd immunoprotection of OmpL1and develop more safe,highl y effective rBCG bearing leptospira l antigen with long-lasting protection.