毛细管电泳测定粉尘螨主要变应原Derf2含量

目的 建立毛细管电泳测定Derf2方法。方法 采用毛细管电泳 安培检测系统 (CE AD)测定Derf2含量。结果 用CE AD测定了标准品Derf2的系列浓度 ,绘制标准曲线 ,线性好。并测定了药厂生产的各批不同浓度的粉尘螨注射液的Derf2含量。结论 CE AD方法具有简便快速、重现性好、样品用量少等优点 。

Der f2重组蛋白用于变应性鼻炎患者血清ELISA检测

目的:以重组表达的野生型粉尘螨变应原蛋白质第2组(Derf2)分作为固相包被抗原,建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法,检测粉尘螨致敏的持续性变应性鼻炎患者血清中的特异性IgE浓度。方法:经过皮肤点刺试验证明的24例粉尘螨反应阳性血清和2例阴性血清作为IgE血清样本。以粉尘螨变应原蛋白质第2组分固相包被酶标板,辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgE单抗作为第2抗体组成测试系统分析特异性IgE。结果:间接ELISA系统检测灵敏度为0.73U.mL-1。在4.0U.mL-1、12.0U.mL-1、22.0U.mL-1浓度,批内重复性和批间重复性分别为9.5%,7%,6.1%和12.8%,9.1%,7.2%。24例皮试阳性患者血清经ELISA分析,有22例阳性。结论:以粉尘螨变应原蛋白质第2组分作为固相包被抗原的间接ELISA法可用来对患者血清sIgE作定量或定性分析,有助于持续性变应性鼻炎的实验诊断。

尘螨变应原Der f 2基因克隆及序列分析

目的:获得尘螨变应原Derf2基因及其生物信息学资料.方法:提取粉尘螨总RNA,RT-PCR合成Derf2的cDNA片段,回收PCR产物并连接至pMD19-Tsimple,经测序验证后亚克隆入表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒,双酶切鉴定.用ExPaSy,EBI,NCBI网站的在线软件对测序结果进行分析.结果:RT-PCR扩增获得了Derf2cDNA片段,酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.与参考序列相比,测序结果多了87bp(77～163),但Blastn发现中国广州和德国Reinbek报道的序列中也含此87bp.同源性、相似性、序列比对及分子进化分析提示,该序列与中国广州和德国Reinbek报道的序列亲缘关系较近.推测该变应原由176个氨基酸组成,与附睾分泌蛋白E1具有同源性,信号肽位于1～17aa处,在6～24aa处有一跨膜螺旋.二级结构由a-螺旋(16.57%),延伸链(32.57%)和随机卷曲(50.86%)组成.结论:获得了粉尘螨变应原Derf2编码基因及其分子特征,为进一步生产基因工程变应原用于临床诊治变态反应性疾病奠定了基础.

粉尘螨变应原第2组分血清特异性IgE酶联免疫吸附测定法的建立及其检测效能的评价

目的建立粉尘螨变应原第2组分(Der f 2)血清特异性IgE的酶联免疫吸附测定(ELISA)法,并评价其检测效能。方法利用重组表达的Der f 2作为包被抗原,分别建立检测Der f 2血清特异性IgE的间接ELISA法和亲和素-生物素复合(ABC)-ELISA法,采用正交试验筛选两种方法的最优检测条件。分别采用上述两种ELISA法检测Der f 2特异性IgE阳性标准血清,绘制两种ELISA法检测Der f 2特异性IgE的标准曲线;同时以Pharmacia Uni Cap系统检测结果为金标准,计算两种ELISA法检测46例哮喘患者血清Der f 2特异性IgE的结果符合率。结果间接ELISA法检测Der f 2特异性IgE的最佳条件为:包被液浓度为10μg/ml,血清稀释倍数为1∶5,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgE抗体稀释倍数为1∶1 000。ABC-ELISA法检测Der f 2特异性IgE的最佳条件为:包被液浓度为15μg/ml,血清稀释倍数为1∶5,生物素标记抗人IgE抗体稀释倍数为1∶1 000,HRP标记的链霉和素稀释倍数为1∶2 000。间接ELISA和ABC-ELISA法的灵敏度值分别为0. 72 U/ml和0. 69 U/ml。间接ELISA和ABC-ELISA检测哮喘患者的符合率分别为93. 5%和95. 7%。结论成功建立基于重组表达Der f 2的ELISA法,其对Der f 2特异性IgE具有较好的检测效能。

尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系构建及可溶性表达

目的建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系并诱导表达。方法以质粒pMD19-T-Der f 2为模板扩增目的基因Der f 2,克隆至pCold TF DNA载体,转化BL21细菌,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和West-ern blot鉴定表达产物。结果 PCR扩增获得Der f 2编码基因,成功构建表达质粒pCold TF-Der f 2。SDS-PAGE检测表明该质粒在大肠埃希菌中正常表达,且基本为可溶性表达,表达产物分子质量单位为69ku,Western blot检测该蛋白能被鼠抗Penta-His抗体识别。结论成功建立尘螨变应原Der f 2编码基因重组pCold TF体系,并实现其可溶性原核表达。