Red重组系统在痢疾杆菌基因敲除中的应用研究

利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术 ,最近发展较快 ,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例 ,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌 ,除dam基因外 ,其余 3个基因均能被有效敲除 ,而在痢疾杆菌中只能敲除一个alkA基因。结果表明 ,为使该系统能有效地应用于痢疾杆菌和其它细菌 ,还需对该系统进行改进。

Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用

在完成了对各种微生物基因组的测序以后,功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统,但是RecA重组系统操作复杂,重组效率低。最近建立了Red重组系统,该系统由3个蛋白组成:α蛋白(即λ核酸外切酶),β蛋白,Gam蛋白。应用Red系统进行基因敲除,可以直接利用线性打靶DNA,两侧同源臂长度在35～60bp即可发生同源重组,且重组效率高。

Cre/lox位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展

来自于P1噬菌体的Cre/lox系统通过位点特异性重组可以迅速而有效地实现各种生理环境下的基因定点插入、删除、替换和倒位等操作。Cre/lox系统作为目前基因打靶技术的核心工具,已被广泛应用于拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、斑马鱼等高等真核模式生物。文章较为全面地介绍了Cre/lox系统的基本概况及其在高等真核生物中的应用,讨论了Cre/lox系统在研究中存在的主要问题和今后的发展方向,为利用该系统在不同高等生物中进行基因操作提供有用的参考。

利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除

利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛β酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体,设计不同的同源臂,成功地敲除了β酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列,插入新的基因,研究其表达功能,或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。

利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草

【目的】利用Cre/lox系统具有的特异重组特性,以绿色荧光蛋白GFP为目的基因,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【方法】将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与GFP基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草后获得抗除草剂Basta的GFP转基因植株。GFP转基因植株叶盘二次转化导入重组酶Cre基因后,实现与GFP基因连锁的Bar基因表达盒剔除,剔除Bar基因的植株开花后自交使重组酶Cre基因分离,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【结果】将含Bar基因表达盒以及GFP基因表达盒的植物表达载体转化烟草Wisconsin38后获得了抗除草剂Basta以及GFP荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入Cre基因,所获得的再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,绝大多数单株对应叶盘在含8mg·L-1PPT(phosphinothricin)的筛选培养基上无法再生死亡,删除效率在76%～100%。对Bar基因删除后区域片段进行克隆测序分析显示,Bar基因表达盒已经被精确删除。Bar基因删除植株开花后自交,获得的自交后代进行NPTⅡ抗性检测,NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有GFP基因。【结论】利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。

利用Cre/lox重组系统获得无选择标记的SKTI抗虫转基因烟草

将置于两个同向lox位点之间的Bar基因表达盒与大豆胰蛋白酶抑制剂SKTI基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草Wisconsin 38后获得对棉铃虫具有明显抗性的SKTI转基因植株。SKTI转基因植株通过叶盘二次转化法导入Cre基因,对再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,检测Bar基因的删除情况。结果表明：绝大多数再生植株对应叶盘在含8 mg/L PPT的筛选培养基上无法再生,Bar基因被删除的效率在38%-100%之间。对Bar基因删除区域进行PCR及克隆测序后发现Bar基因表达盒被精确删除。对Bar基因删除植株开花自交获得的分离后代进行NPTⅡ抗性检测,5株NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有SKTI基因而无Cre基因存在,为无选择标记基因的SKTI转基因植株。

基于Cre/loxP重组系统的多基因载体构建及烟草转化研究

利用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCryIAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于植物表达载体pYL1305上,命名为pYL1305BBGR。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR和Southern blot检测发现,多基因已成功转入烟草基因组中;经半定量RT-PCR检测证实,4个基因均能正常表达。

Cre-lox重组系统介导转基因烟草中外源基因删除的研究

对Cre在转基因个体中介导的重组效率进行了研究。构建了含有Cre基因 (p35S Cre)和GUS基因侧翼含同向loxP位点的 (loxP p35S GUS loxP)两种植物表达载体。以共转化的技术将两种基因元件同时转化烟草得到转基因植株 ,根据对共转化植株GUS基因的活性分析、分子检测、PCR检测及对重组后扩增DNA片段进行序列分析表明 :Cre loxP重组系统在转基因烟草中能精确高效地介导转基因的删除 ,但也存在部分植株不能完全删除的现象。

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。

利用Red重组系统敲除大肠杆菌rnc基因构建dsRNA原核表达体系

大肠杆菌的rnc基因编码产物为RNaseIII酶,RNaseIII酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。利用来源于λ噬菌体的Red重组系统和重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR),敲除了大肠杆菌origami(DE3)菌株的rnc基因,获得了RNaseIII缺失型菌株M-origami。利用电激法,将构建的TMV运动蛋白基因(movement protein gene,MP)的dsRNA表达载体LMP480导入M-origami菌株中,IPTG诱导表达的结果显示:构建的M-origami/LMP480原核表达系统能高效表达TMV运动蛋白基因的dsRNA。初步的抗病性鉴定显示,表达的dsRNA能够诱发烟草对TMV的抗性。

利用Cre/lox重组系统建立番茄基因工程雄性不育恢复系

【目的】利用Cre/lox重组系统具有的重组删除特性建立番茄工程恢复系,特异删除F1中的雄性不育基因恢复其育性。【方法】将TA29-Barnase雄性不育基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与NPTⅡ基因、Bar基因融合后获得植物表达载体pBinBarloxTABn,转化番茄获得雄性不育转基因植株。Cre基因在CaMV35S启动子的驱动下转入番茄获得工程恢复系。两者在开花时进行杂交,利用Cre重组酶删除F1中的TA29-Barnase不育基因表达盒使育性恢复。【结果】利用NPTⅡ作为转化筛选标记基因获得了番茄雄性不育转基因植株。转基因植株中的Bar基因能正常表达,真叶叶盘在含PPT3mg·L-1(phosphinothricin)分化培养基上能分化愈伤组织及芽;真叶具有抗PPT20mg·L-1浓度以上的能力。获得的TA29-Barnase转基因植株表现雄蕊退化、无花粉产生或产生少量形状畸形且无生活力的花粉。雄性不育植株自花授粉不能坐果,用非转基因保持系花粉授粉后,果实正常膨大结籽,杂交后代对除草剂Basta的抗性按1﹕1分离。不育植株与Cre转基因工程恢复系杂交后,果实也正常膨大结籽。对不育植株与Cre转基因工程恢复系杂交后代进行分子检测,结果发现同时含Bar基因和Cre基因F1植株中的TA29-Barnase雄性不育基因被精确删除。TA29-Barnase基因删除植株育性被恢复,能正常开花结果。【结论】利用Cre/lox重组系统建立的Cre工程恢复系成功将番茄F1代中的不育基因删除,恢复了F1的育性。该研究结果为植物基因工程雄性不育系的育性恢复提供了一条新的途径。

利用λ-Red重组系统和平衡致死系统改造抗药性致腹泻工程疫苗

质粒pMM085是含有猪毒素源性大肠杆菌(ETEC)的黏附素K88与无毒肠毒素LTA-B+基因的重组质粒,含氯霉素抗性基因,由此构建的菌苗株带有抗药性。利用平衡致死系统改建此疫苗株,即将质粒上的氯霉素抗性基因cat替换成asd基因,并把新构建的质粒转移到缺失asd基因的大肠杆菌X6097中。但由于质粒pMM085是一个23kD的大质粒,传统的基因工程操作不易进行,利用λ-Red重组系统,将表达Red重组蛋白的质粒pKD46转化含pMM085的大肠杆菌X6097,并用两端各带有39ntcat基因同源区、含全长asd基因的PCR产物电击转化此感受态细胞,在λ-Red重组系统的帮助下,成功实现了asd基因对cat基因的置换。

利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因

目的:利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。方法:以伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi Ty2,S.ty2)基因组为模板扩增得到的同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化S.ty2;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过卡那抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以去除抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;通过PCR鉴定重组菌,并经透射电子显微镜分析表型。结果:在S.ty2中敲除了rfaH基因,经PCR扩增和序列测定正确;初步的表型分析表明突变体的鞭毛合成显著减少。结论:获得了S.ty2突变株,为将沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定了基础。

构建重组系统分析回文结构对基因表达的影响

回文结构序列是最常见的一种DNA序列 ,它是许多基因表达调控因子的顺式作用元件。本文设计了不同长度的回文结构序列 ,构建了Cre loxP重组系统 ,通过共转化含有cre基因的质粒和含有loxp位点的质粒 ,观察共转化菌株质粒图谱的变化 ,研究了重组系统在细菌中对基因表达的作用 ,同时研究不同长度回文结构对基因表达的影响 ,结果发现长度在 2 0bp以下回文序列对下游基因的表达没有影响 ,而长于 3

Cre/loxP定位重组系统在植物雄不育和杂种优势中的利用研究

Cre loxP是来源于噬菌体P1的一种位点特异性重组系统。目前 ,它已广泛应用于基因功能鉴定 ,动植物及微生物基因组的修饰以及基因的表达和调控。雄性不育系在杂种优势的利用中具有重要意义。本实验是以Cre loxP系统调控细胞毒素基因barnase在植物雄性器官发育的特异时期在特异组织表达 ,从而达到控制植物育性的目的。1 在本实验中 ,通过PCR方法克隆了解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens的barnase基因 ,及其抑制因子barstar的DNA序列 ,同时 ,构建成功双元表达载体及基因枪转化载体 ,并已获得经分子检测呈阳性的小麦植株。2 osg6B是来源于水稻花药绒毡层的特异性的启动子 ,它在小孢子发育的四分体时期至单核花粉期在花药绒毡层中特异启动基因的表达 ,它具有较为严紧的时空特异性。以osg6B为启动子 ,构建了一组受控于Cre/loxP位点特异性重组系统的适用于基因枪法转化小麦的载体系统。其中 ,转不育基因(og6B barnase)小麦植株生长正常 ,但开花后 ,花粉量明显减少 ,自交不能得到正常种子。进行花粉活力检测发现 ,转基因小麦大部分花粉表现为败育。花粉离体萌发试验表明 ,转不育基因小麦的花粉离体萌发率极低 ,几近败育。说明以osg6B驱动barnase在小麦花药中的表达可以导致雄性不育。3

利用Cre/loxP重组系统构建甜菜碱合成酶多基因表达载体

通过使用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体构建系统,将辽宁碱蓬（Suaeda liaotungesis kitag）的胆碱单加氧酶（CMO）基因、甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因以及烟草的核基质结合区（MAR）序列构建到同一表达载体上,得到可直接用于农杆菌转化的植物表达载体pYLTAC747H-MAR-BADH-CMO-MAR.该甜菜碱合成酶多基因表达载体的成功构建为进一步进行植物的遗传转化,以有效提高转基因植株的耐盐性提供了实验基础.实验中,用热激法替代了电击法进行质粒的大肠杆菌转化,并去掉了透析等步骤,简化了构建过程.

单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统的构建

来自于啤酒酵母2μm质粒的FLP/frt位点特异性重组系统可用于转基因植物(细胞)筛选完成后去除选择标记基因.水稻肌动蛋白actin基因启动子和玉米泛素ubiquitin基因启动子可有效驱动单子叶植物中外源基因的转录.为培育去除选择标记基因的抗盐耐旱单子叶转基因植物,构建了适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统.该系统由含有FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-FLP-bar和含有frt位点的植物双抗(抗除草剂、抗盐耐旱)表达载体pCAMBIA1300-Ubi-TsPPasef-rt-alsf-rtm以及pCAMBIA1300-Actin1-AtNHX1f-rt-alsf-rtm组成.

Red重组系统介导下大肠杆菌改造体系的优化

对Red重组系统介导下大肠杆菌进行遗传改造的转化条件、诱导条件、复苏条件三方面实验参数进行优化研究。结果表明:电转化加入的DNA为20ng,Red重组系统感受态细胞培养浓度为OD600=0.60,所需的电击感受态细胞数为3×108;对大肠杆菌基因做双敲除时,突变第2个基因的阿拉伯糖诱导最适时间比突变首个基因延长,诱导浓度为40μm,复苏时间变化对体系影响不显著。

利用Cre-LoxP重组系统构建gdh1基因敲除的酿酒酵母重组菌

基于PCR介导的基因敲除原理,采用Cre-LoxP重组系统技术,对2倍体酿酒酵母的SS04菌株的gdh1基因进行敲除操作,构建gdh1基因完全缺失型的酿酒酵母重组菌SS17菌株,进而为后续重组酵母的乙醇代谢研究打下基础.