5-氟尿嘧啶联合重组人细胞珠蛋白治疗缺氧诱导化疗耐受肝细胞癌的体外实验

目的探讨联合使用重组人细胞珠蛋白(rhCYGB)靶向缺氧诱导的5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗耐受在肝癌中的作用及机制。以期为改善难治性肝癌提供一种新的联合治疗策略。方法在常氧和缺氧条件下检测不同药物对肝癌细胞的半数抑制率并绘制量效曲线,评估不同氧浓度下肝癌细胞对5-FU的敏感性。使用CompuSyn和SynergyFinder 3.0软件分析不同浓度rhCYGB和5-FU在常氧和缺氧条件下处理肝癌细胞的联合效应。肿瘤干细胞成球实验评估联合用药对肝癌干细胞性的作用。流式细胞术检测联合用药对CD133阳性细胞亚群比例的影响。划痕实验评估联合用药对肝癌细胞迁移的影响。结果缺氧条件下5-FU处理Hep3B、Huh7和HepG2细胞IC50值显著高于常氧条件下IC50值(P<0.05),分别为常氧条件下的15.27、4.25、2.34倍。常氧和缺氧条件下5-FU联合rhCYGB具有协同效应。与5-FU单药组相比,5-FU联合rhCYGB对肝癌干细胞球的形成具有抑制作用(P<0.05),且可显著下调Hep3B细胞中CD133阳性亚群比例(P<0.05)。常氧条件下rhCYGB联合5-FU处理48 h后对Hep3B细胞的迁移具有联合抑制作用(P<0.05)。结论rhCYGB与5-FU联合运用在肝癌中具有协同效应;联合机制可能涉及干细胞性及细胞迁移能力的调控。

聚乙二醇修饰重组细胞珠蛋白对小鼠急性肝损伤的保护作用

旨在探究聚乙二醇修饰重组细胞珠蛋白(PEG modified recombinant cytoglobin,PEG-rCygb)对小鼠急性肝损伤的保护作用。采用CCl4诱导KM小鼠急性肝损伤模型,尾静脉注射PEG-rCygb,收集血清及肝脏组织检测各项生化指标及组织病理学变化。结果表明,PEG-rCygb治疗组小鼠肝脏系数减小,血清中AST﹑ALT水平降低,肝组织匀浆中MDA含量减少,GSH含量增加,T-SOD、CAT活性升高。肝组织切片HE染色显示PEG-rCygb可以缓解肝细胞脂肪变性,减少炎症因子,减轻肝细胞损伤。体外细胞学实验表明rCygb经PEG修饰后对H2O2造成的肝星状细胞(HSC)氧化损伤发挥的保护作用增强。研究结果显示PEG-rCygb提高了机体对自由基的清除能力,对CCl4引起的小鼠急性肝损伤具有保护作用。

重组细胞珠蛋白抗衰老与创伤愈合的初步研究

本研究利用实验室纯化得到的重组细胞珠蛋白(rCygb),通过人永生化角质形成细胞(HaCAT)H2O2氧化应激模型、小鼠皮下连续注射D-gal导致的皮肤衰老模型、CCl4引起的大鼠急性肝损伤模型和大鼠皮肤创伤愈合模型,对rCygb抗氧化、增强机体抗氧化酶活性、降低氧自由基含量、延缓皮肤衰老以及创伤愈合作初步研究。结果表明:rCygb可以提高总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性;降低乳酸脱氢酶(LDH)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性;减少丙二醛(MDA)含量。皮肤切片展示rCygb可以促进新生血管生成、增加胶原表达和提高抗炎能力。研究结果显示:rCygb可通过改善机体清除氧自由基的能力,延缓皮肤衰老和促进创伤愈合。

重组人源细胞珠蛋白单抗制备及检测方法建立

目的制备重组人源细胞珠蛋白(recombinanthumanCytoglobin,rhCygb)单克隆抗体,并建立检测该蛋白双抗体夹心ELISA法,为下一步研究rhCygb药代动力学做准备。方法用纯化的rhCygb免疫BALB/c小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法获得抗rhCygb的单克隆抗体杂交瘤细胞,间接ELISA法筛选制备单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA法。结果筛选获取了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过抗原表位相加法实验获得5株表位不同的细胞株,Western-blotting验证能与rhCygb特异性结合,间接ELISA法验证其不与本实验室制备的其它PET28a-BL21蛋白及BL21裂解液发生交叉反应。本方法灵敏度为1.25ng/ml,在浓度为10～1250ng/ml时,线性关系良好,相关性达0.9931,实验内和实验间平均变异系数分别为6.2%和10.92%。结论成功建立了灵敏度好、特异性高的双抗体夹心法,为下一步研究rhCygb药代动力学奠定了基础。